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细粒棘球蚴抗原B表位结构的预测分析和多表位重组抗原的构建
目的 对细粒棘球蚴抗原B (EgAgB)的3个亚单位(EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4)的反应性表位的结构进行预测分析并进行基因重组,鉴定构建的多表位重组抗原的反应性. 方法 用Bioedit和Discovery Studio Visualizer分析软件和I-TASSER在线服务器对EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4等3个亚单位抗原序列及其不同组合方式的组合序列进行分析和结构预测.选择结构预测评分较高的表位或亚单位组合方式进行基因重组.设计特异性重叠引物,用重叠延伸PCR技术扩增目标序列.将目标序列克隆至pET32a(+)载体中构建表达质粒表达重组蛋白,表达产物经纯化后即为多表位重组抗原.采用蛋白质印迹(Western blotting)分析鉴定多表位重组抗原的反应性. 结果 结构预测显示,EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4等3个亚单位的主要表位均呈“Z”字型结构,且主要表位区域亦均位于序列的中部;对拟进行组合的3个EgAgB亚单位和4个主要表位(KK36、RK30、B4-2和B4-3)的57种不同的组合方式进行了结构预测,选择6种组合方式进行重组表达.对6个多表位重组抗原(MEA-8、MEA-20、MEA-26、MEA-36、MEA-49和MEA-52)进行的Western blotting分析显示,多表位重组抗原与细粒棘球蚴病患者血清的反应条带明显强于AgB亚单位抗原. 结论 构建的6个多表位重组抗原与细粒棘球蚴病患者血清的反应性明显强于EgAgB亚单位抗原.
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细粒棘球蚴重组铁蛋白和重组线粒体苹果酸脱氢酶免疫差异的初步观察
目的 比较细粒棘球蚴重组铁蛋白(rEgferritin)和重组线粒体苹果酸脱氢酶(rEgmMDH)对感染细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)小鼠的免疫差异.方法 30只雌性ICR小鼠随机分为3组(rEgferritin免疫组、rEgmMDH免疫组和对照组).将rEgferritin、rEgmMDH和PBS与佐剂乳化后,分别于背部皮下多点注射免疫小鼠,每次注射100μl/只(含抗原10μg),共免疫3次,每次间隔2周.末次免疫后2周,3组小鼠分别于腹腔注射0.1ml原头节悬液(约1 500个)进行攻击感染,22周后剖杀,无菌取脾组织,并记录包囊数量和直径,评价免疫保护力.用流式细胞仪检测脾组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞,计算两者比例.结果 rEgferritin免疫组30％ (3/10)小鼠有包囊,包囊总数为5个；rEgmMDH免疫组小鼠均有包囊,包囊总数为118个；对照组9只小鼠中7只有包囊,包囊总数为35个.rEgferritin免疫组小鼠获得了84.7％的免疫保护力,而rEgmMDH组无免疫保护力.小鼠脾淋巴细胞CD4+亚群百分比,rEgferritin免疫组[(5750±7.02)％]显著高于对照组[(43.60±6.09)％](P＜0.05).小鼠脾淋巴细胞CD8+亚群百分比,rEgferritin免疫组[(25.66±6.18)％]和rEgmMDH免疫组[(19.23±5.40)％]与对照组[(21.80±6.12)％]比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).小鼠脾淋巴细胞CD4+/CD8+亚群比值,rEgferritin免疫组和rEgmMDH免疫组与对照组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05) 结论 rEgferritin能抑制细粒棘球蚴的生长,而rEgmMDH促进了细粒棘球蚴的生长.
关键词： 细粒棘球绦虫 重组铁蛋白 重组线粒体苹果酸脱氢酶 免疫保护 -
细粒棘球蚴抗原EPC1基因的克隆、表达及其免疫诊断的研究
目的 克隆、表达细粒棘球蚴EPC1(EgEPC1)基因,鉴定重组抗原的反应原性,并用棘球蚴病患者血清评价其诊断价值.方法 从绵羊肝脏棘球蚴囊中分离原头节,提取其总RNA,采用RT-PCR扩增EgEPC1基因,将其克隆至pGEM-T载体,再将其与原核表达载体PET28a(+)连接构建重组质粒PET28a-EgEPC1,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)对纯化的重组抗原进行鉴定分析.以该重组蛋白作为包被抗原建立ELISA方法,检测细粒棘球蚴病患者血清(60份)特异性IgG抗体,同时以多房棘球蚴病(37份)、囊尾蚴病(16份)、华支睾吸虫病(7份)、日本血吸虫病(4份)患者和健康人血清(33份)作为对照,评价重组抗原EgEPC1的免疫诊断效果.结果 双酶切鉴定和测序结果均显示重组质粒PET28a-EgEPC1构建成功.SDS-PAGE和Western blotting分析显示,重组质粒PET28a-EgEPC1在E.coli BL21(DE3)中获得高效表达,产物以可溶蛋白形式存在,重组蛋白EgEPC1的相对分子质量(Mr)约为11 000,可被细粒棘球蚴病患者混合血清识别.EgEPC1对细粒棘球蚴病患者血清的诊断敏感性和特异性分别为78.3%(47/60)和98.3%(59/60),与多房棘球蚴病患者血清交叉反应阳性率为40.5%(15/37).结论 EgEPC1重组抗原对细粒棘球蚴病具有较好的诊断价值.
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细粒棘球绦虫Eg95-EgA31融合基因苜蓿叶蛋白提取液诱导小鼠细胞因子的变化
目的 探讨细粒棘球绦虫(Eg)Eg95-EgA31融合基因苜蓿叶蛋白提取液免疫小鼠被Eg原头节攻击感染后体内棘球蚴囊重减少率及细胞因子的变化. 方法 热絮凝法提取转基因苜蓿叶蛋白,同时提取转空质粒(pBI121)苜蓿叶蛋白和正常苜蓿叶蛋白作对照.32只雌性BALB/c小鼠随机均分4组,A和B组分别用转基因苜蓿叶蛋白提取液100 *9滋l灌胃和10 *9滋l滴鼻免疫小鼠,C组用转空质粒苜蓿叶蛋白提取液10 *9滋l滴鼻免疫小鼠,D组用正常苜蓿叶蛋白提取液100 *9滋l灌胃免疫小鼠.各组小鼠每3 d免疫1次,连续免疫2个月.末次免疫后第8周,各组小鼠用Eg原头节腹腔注射攻击感染(50个/只),感染后第24周剖杀小鼠,分离并称重细粒棘球蚴囊,计算囊重减少率;取脾,分离脾细胞,用Eg粗抗原(EgAg)、伴刀豆球蛋白A(ConA)或脂多糖(LPS)刺激培养,收集脾细胞培养上清液,常规ELISA法检测脾细胞培养上清液中白介素-12(IL-12)、白介素-10(IL-10)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平. 结果 A、B、C和D组小鼠的棘球蚴囊重分别为(28.0±36.0)、 (41.0±33.0)、 (72.0±36.0)和(78.0±57.0)mg,A组低于D组(P<0.05),囊重减少率为64.1%.A组的IFN-γ、 1L-12和TNF-α水平高于D组(P<0.01), 分别为(925.0±88.6) 、 (22.5±2.7) 和(82.5±11.7) pg/ml, IL-10水平低于D组(P<0.01), 为(125.0±26.7) pg/ml;B组小鼠脾的IFN-γ和TNF-α水平高于D组(P<0.01), 分别为(750.0±100.0) 和(80.0±13.1) pg/ml, IL-12和IL-10水平与D组相比差异无统计学意义(P>0.05);C组小鼠脾细胞因子水平与D组相比,差异无统计学意义(P>0.05).当用EgAg、ConA或LPS刺激时,刺激组的细胞因子水平高于相应的未刺激组(P<0.05或P<0.01),ConA或LPS刺激组的细胞因子水平高于EgAg刺激组(P<0.05或P<0.01). 结论 转细粒棘球绦虫Eg95-EgA31融合基因苜蓿叶蛋白提取液可诱导免疫鼠产生Th1型细胞免疫应答以对抗Eg原头节的攻击感染.
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细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31蛋白对感染小鼠脾细胞凋亡的抑制作用
目的 探讨细粒棘球绦虫(Eg)重组蛋白Bb-Eg95-EgA31免疫小鼠被Eg原头节攻击感染后小鼠体内生成的棘球蚴囊重减少率及脾细胞凋亡的变化.方法 56只雌性BALB/c小鼠随机均分7组,分别为重组蛋白皮下注射组(A组)、肌肉注射组(B组)、鼻腔内接种组(C组)、灌胃组(D组)、空载体对照组(E组)、双歧杆菌对照组(F组)和双歧杆菌液体培养基(MRS)对照组(G组).A、B和D组分别以5×10~6、5×10~6和5x10~8蛋白克隆形成单位(CFU)悬浮于100μl MRS免疫小鼠,C组以5×10~5蛋白克隆形成单位(CFU)悬浮于10μl MRS免疫小鼠,E和F组分别以空载体[Bb(pGEX-1λT)]和Bb 5x10~6 CFU悬浮于100μl MRS皮下注射小鼠,G组以100μl MBS皮下注射小鼠.8周后各组均用Eg原头节(50个/只)攻击感染,25周后剖杀小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重减少率;取脾,分离脾细胞,伴刀豆球蛋白(ConA)刺激培养,流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率.结果 A、B、C和D组小鼠的棘球蚴囊重分别为(41.0±23.O)mg、(44.0±22.0)mg、(22.0±21.0)mg和(28.0±16.0)mg,均低于G组(75.0±33.0)mg(P<0.015,P<0.01),A、B、C组与D组间囊重差异无统计学意义(P>0.05);E组(63.0±30.0)mg、F组(69.0±22.0)mg和G组间囊重差异无统计学意义(P>0.05).未加ConA培养的脾细胞凋亡发生率,A(0.14±0.01)、B(0.14±0.01)、C(0.13±0.01)和D组(0.14±0.01)均低于G组(0.21±0.01)(P<0.05);C组低于A、B和D组(P<0.05);E组(0.20±0.01)、F组(0.20±0.01)和G组间差异无统计学意义(P>0.05);加ConA培养后的脾细胞凋亡发生率,A(0.19±0.01)、B(0.20±0.00)、C(0.17±0.01)和D组(0.19±0.01)均显著低于G组(0.26±0.01)(P<0.01),C组低于A和B组(P<0.01),C组低于D组(P<0.05),D组低于B组(P<0.05),A组与B组、D组间差异无统计学意义(P>0.05),E组(0.25±0.01)、F组(0.25±0.01)和G组间差异无统计学意义(P>0.05).各组小鼠加C0nA培养的脾细胞凋亡率显著高于相应的未加ConA培养组(P<0.01).结论 Eg原头节感染可引起小鼠脾细胞凋亡,用Eg重组蛋白Bb-Eg95-EgA31免疫小鼠在一定程度上可抑制感染鼠脾细胞的凋亡,诱导小鼠产生一定的保护力.
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复频高强度聚焦超声对离体细粒棘球蚴囊壁超微结构的影响
目的 分别用单频和多频聚焦超声体外照射细粒棘球蚴包囊,观察对其囊壁的损伤情况.方法 用羊肝细粒棘球蚴原头节接种小鼠,1年后处死,自腹腔取出包囊,选择直径约2 cm的包囊40只随机均分4组.对照组剪破包囊壁,用3%戊二醛固定并立即冷藏.实验A组包囊用2号单频换能器(4 W)照射,实验B组用2及3号双频换能器(功率分别为4和5 W)同时照射,实验C组用1、2及3号3频换能器(功率分别为4、4及5 W)同时照射.各组均照射1 min,然后立即用3%戊二醛崮定并冷藏.用肉眼、扫描电镜及透射电镜观察其变化.结果 肉眼见实验组囊壁变厚,颜色浑浊.透射电镜观察显示,随超声频数增加囊壁结构被破坏程度加重,角皮层纤维增粗、紊乱,生发层细胞核肿胀破裂,线粒体明显受损,微绒毛变短,断裂或消失.部分区域仅剩细胞碎片和破裂的细胞核.扫描电镜观察显示,随超声频数增加,囊壁内外表面被破坏程度加重,终正常结构被完全破坏.结论 在体外,复频高强度聚焦超声对小鼠细粒棘球蚴囊壁损伤明显,其损伤程度随超声频数的增加而加重.
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细粒棘球绦虫抗原B重组蛋白的免疫反应性
目的 利用基因工程方法表达细粒棘球绦虫抗原B重组蛋白(rAgB),并分析其免疫反应性.方法 将rAgB基因片段插入原核表达载体pET41a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,经异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得重组蛋白rAgB-GST.用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析柱(GST-sepharose 4B)纯化,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的表达情况.用蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫反应性,并用免疫胶体金包虫诊断试剂盒作为对照.结果 PCR、舣酶切及DNA测序结果均显示重组质粒pET41a-rAgB构建成功.SDS-PAGE结果表明,重组蛋白rAgB-GST的相对分子质量(Mr)为40 800,纯化蛋白含量为78.4%.Western blotting分析结果显示.重组蛋白rAgB-GST检测细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病患者血清的阳性率分别为79.2%(95/120)和51.1%(23/45),但与卫氏并殖吸虫病患者、华支睾吸虫病患者血清以及健康人血清反应均为阴性.rAgB-GST的敏感性和特异性分别为79.2%(95/120)和81.0%(98/121),均略高于免疫胶体金棘球蚴病诊断试剂盒的敏感性(72.8%,75/103)和特异性(76.9%,30/39).结论 重组rAgB-GST蛋白可被细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病患者血清识别,有较好的免疫反应性.
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甘南藏族自治州动物棘球绦虫感染状况调查
目的 了解甘南藏族自治州动物棘球绦虫及棘球蚴的感染状况,为该地区制定防制策略提供依据.方法 2004年8月-2007年9月在甘南藏族自治州选择玛曲县和碌曲县的8乡21个自然村为调查点.采用鼠夹、粘鼠板捕捉啮齿类动物进行剖检,收集当地屠宰场绵羊、牦牛的肝、肺和心脏等剖检,进行棘球蚴病原学和病理学检查.对家犬、牧羊犬采用15%槟榔碱溶液驱虫,随机捕杀无主野犬剖检十二指肠成虫感染情况. 结果 共捕获啮齿类动物331只,经剖检进行病理学检查和鉴定,4只感染多房棘球蚴.即达乌尔鼠兔(Ochotona daurica)和中华鼢鼠(Myospalaxfontanieri),感染率分别为1.2%(1/87)和2.3%(3/132);6只喜马拉雅旱獭(Marmota himalayana)、34只西藏鼠兔(Ochotona tibetana)和72只小家鼠(Mus musculus)未感染棘球蚴.剖检绵羊1 021头.其中细粒棘球蚴和多房棘球蚴的感染率分别为11.1%(113/1 021)和0.3%(3/1 021).剖检牦牛634头,其细粒棘球蚴和多房棘球蚴的感染率为19.9%(126/634)和0/3%(2/634).犬的细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的感染率分别为23.0%(17/74)和5.4%(4/74).牧羊犬、家犬棘球绦虫的检出率为24.6%(15/61),无主野犬检出率为6/13,未发现两型绦虫的混合感染. 结论 甘南藏族自治州动物以细粒棘球绦虫感染为主,有少量多房棘球绦虫感染.
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过氧化氢体外诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡的实验观察
目的 探讨过氧化氢(H2O2)体外诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡,方法 体外培养细粒棘球蚴原头节,实验分为2组,即RPMI 1640组及RPMI 1640添加谷氨酰胺组,分别用不同浓度的H2O2诱导,使其发生细胞凋亡.用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术(TUNEL法)检测凋亡细胞;用过氧化物酶标记链酶卵白素(SP)染色-免疫组化法检测半胱天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)、半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)以及FAS基凶蛋白(跨膜蛋白Fas)表达情况.表达产物用二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染.TUNEL反应以细胞核黄染者为阳性细胞,caspase-1和caspase-3以细胞浆被染成棕黄色为阳性细胞,Fas 以细胞膜和细胞浆被染成棕黄色为阳性细胞,无黄染者为阴性细胞.根据每个原头节中阳性细胞数所占百分比,对原头节阳性表达程度分为4个级别,即原头节中阳性细胞数＜5%为"-",5%～25%为"+",26%～50%为"++".＞50%为"+++".实验重复2次.各组均设空白对照组.结果 RPMI 1640组,1 mmol/L H2O2诱导12 h,查见典型的TUNEL反应阳性细胞；诱导4 h,caspase-1表达86.6%为"+～++",cas pase-3表达77.8%为"+～++"；诱导8 h,caspaae-1表达86.6%为"+～++'',caspase-3表达80.0%为"+～++".均比对照组明显增加(P＜0.05).而5 mmol/L H2O2诱导4 h,caspase-1表达93.0%为"++～+++",caspase-3表达89.5%为"+～++"；诱导8 h,caspase-1表达"++～+++"降为53.2%,caspase-3表达"+～++"降为48.4%且阴性表达为46.8%,降低显著(P＜0.01).添加谷氨酰胺(终浓度为2mmol/L)组,5mmol/L H2O2诱导8 h,caspase-3 100%为"++～+++"高度阳性表达.与平行的RPMI 1640组(caspase-3表达"++～+++"为32.2%,且阴性表达为46.8%)相比,变化明显.原头节在对照组和诱导组均可见Fas阳性表达细胞,RPMI 1640组5 mmol/L H2O2诱导4 h,"+～++"表达为53.0%,对照组为20.0%；RPMI 1640添加谷氨酰胺组5 mmol/L H2O2诱导8 h,"+～++"表达为88.7%,对照组为71.4%,诱导后均有所增加(P＜0.05). 结论 H2O2可诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡.
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以家犬驱虫为中心的棘球蚴病控制措施在新疆两县的应用
目的 通过新疆呼图壁县和温宿县区域试验,验证以家犬(包括牧犬)驱虫为中心的棘球蚴病控制措施的可行性和控制效果.方法 1987-1990年在新疆呼图壁县和1990-1994年在新疆温宿县分别建立棘球蚴病控制试验区,采用消灭病原以阻断循环链的控制策略,即"犬犬驱虫、月月投药"的措施,对试验区所有家犬用吡喹酮药饵剂型进行预防性驱虫.实施控制措施后,每年在试验Ⅸ检测犬的细粒棘球绦虫和绵羊的棘球蚴感染率,以评价驱虫效果.结果 经过连续3～4年实施"犬犬驱虫、月月投药"措施.呼图壁县和温宿县的家犬细粒棘球绦虫平均感染率分别从实施前的18.5%和14.7%降为0;两县新生绵羊的棘球蚴平均感染率比控制模式实施前降低了85%以上.结论 以家犬驱虫为中心的策略,即"犬犬驱虫.月月投药"的措施对控制家犬的棘球绦虫病和绵羊的棘球蚴病是有效可行的.
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高强度聚焦超声辐照后细粒棘球蚴囊壁的病理变化
目的 观察细粒棘球蚴囊壁在高强度聚焦超声(HIFU)辐照后的病理改变.方法 采集感染细粒棘球蚴的新鲜羊肝,选取囊壁较薄、触摸弹性较好的细粒棘球蚴30个.采用随机抽样方法等分为3组,每组10个包囊.对照组,用普通诊断超声照射2 min.处理组1和处理组2分别用150 W和250 W声功率对细粒棘球蚴包囊进行沿囊壁多层面的环形扫描,层面间距为5 mm,扫描速度为3 mm/s,照射时间2～10 min(根据包囊大小).取出照射后先肉眼观察细粒棘球蚴包囊大体改变,后取囊壁组织分别制作病理切片和透射电镜切片,观察其病理改变.结果 HIFU(250 W)辐照后,细粒棘球蚴包囊剪开处内囊壁立即发生卷曲,剥离出的内囊颜色变白、变硬、透光度降低.病理切片显示,HIFU辐照后细粒棘球蚴的内囊壁上角皮层与生发层大部分发生分离.电镜观察结果显示,HIFU辐照后细粒棘球蚴的角皮层纤维纹理明显改变,生发层细胞发生裂解性破坏.结论 HIFU沿细粒棘球蚴囊壁的多层面的环形照射可明显损害细粒棘球蚴囊壁.
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细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导小鼠脾细胞淋巴因子变化的研究
目的 探讨细粒棘球绦虫(Eg)重组BCG-Eg95疫苗免疫后对受攻击小鼠的包囊减重率及脾细胞淋巴因子的影响.方法 细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗分别采用皮下注射、鼻腔内接种、口服灌胃和肌肉注射4种途径免疫BALB/C小鼠,免疫后8周用Eg原头节攻击感染,50个Eg原头节/每只小鼠,感染后18周剖杀小鼠,分离并称重细粒棘球蚴,计算包囊减重率;取脾,分离脾细胞,用Eg粗抗原(EgAg)或伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激培养,收集脾细胞培养上清液,检测脾细胞培养上清液的白介素-2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素-4(IL-4)水平.同时设卡介苗(BCG)和磷酸盐缓冲液(PBS)对照.结果 以上4种疫苗接种组的包囊减重率分别为45.77%、18.20%、88..05%和92.46%;疫苗肌肉接种组的IL-2、IFN-γ和TNF-α均较PBS对照为高,分别为(30.0±0)pg/ml、(65.0±0)pg/ml和(425.0±10.7)pg/ml,IL-4低于PBS对照组,为(10.0±0)pg/ml.结论 细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导小鼠产生辅助性T细胞1型(Th1)反应,从而对抗Eg原头节攻击感染.
关键词： 细粒棘球绦虫 重组BCG-Eg95疫苗 细胞因子 -
犬体内细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的混合感染
目的证实家犬体内是否存在细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫混合感染.方法从新疆和静县巴音布鲁克草原现场收购的30条牧羊犬,经麻醉后处死解剖,在1只雌性牧羊犬小肠内发现棘球绦虫成虫1万条以上,经显微镜观察,疑为细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫混合感染.用Eglf/r和EM-15/17EM引物分别对两种棘球绦虫的线粒体DNA特异目的片段进行序列分析鉴定.结果形态学观察:细粒棘球绦虫孕节长大,生殖孔偏后,位于节片一侧中部.子宫有不规则的分支和侧突(侧囊),内含虫卵200～800个.多房棘球绦虫较短小,4～5体节.孕节中子宫呈简单的囊状,无侧囊.生殖孔开口于侧缘的前半部.线粒体12S RNA序列鉴定,扩增样本DNA经同源序列比较发现,与细粒棘球绦虫G1型具有相同的序列;扩增样本与多房棘球绦虫具有相同的序列.分别确定为细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫两种虫种.结论首次证实家犬体内存在细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的混合感染.
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细粒棘球绦虫Eg95抗原基因疫苗体外瞬时表达及对小鼠诱导的免疫应答
目的检测细粒棘球绦虫Eg95抗原基因疫苗(pcDNA3-Eg95)体外瞬时表达,探讨其诱导小鼠的体液和细胞免疫效果.方法 pcDNA3-Eg95经脂质体转染HeLa细胞瞬时表达.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Eg95抗原信使RNA(mRNA)在HeLa细胞中的表达,酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白质印迹法(Western blotting)检测Eg95蛋白的瞬时表达情况.pcDNA3-Eg95基因疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA检测IgG和IgG2a水平,四甲基偶氮唑盐试验(MTT法)检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖反应.结果 RT-PCR检测结果显示,pcDNA3-Eg95瞬时表达组有Eg95抗原基因mRNA表达,ELISA和Western blotting检测结果表明,可在HeLa细胞中特异性表达Eg95蛋白.用pcDNA3-Eg95基因疫苗免疫BALB/c小鼠,第3周出现特异性IgG免疫应答,持续升高至第10周,显著高于对照组.从第2周开始,小鼠血清IgG2a应答即为阳性,且长时间(至第10周)维持较高水平,与pcDNA3空质粒组比较,其差异具有非常显著性意义(P＜0.01).用原核表达的Eg95重组蛋白刺激免疫小鼠脾细胞,有明显的T细胞增殖反应.pcDNA3-Eg95基因疫苗免疫组刺激指数明显高于pcDNA3空质粒组(P＜0.01).结论pcDNA3-Eg95基因疫苗可诱发小鼠产生特异的体液免疫和细胞免疫应答.
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阿苯达唑乳剂治疗肝囊型包虫病212例临床疗效观察
目的验证新剂型阿苯达唑乳剂对肝囊型包虫病患者的临床疗效.方法对212例肝囊型包虫病患者用阿苯达唑10 mg/(kg@d)和12.5 mg/(kg@d)两种剂量进行治疗.服药3个月复查1次为1个疗程,各疗程之间不间断连续用药.以B超影像特征为主判定疗效,观察不同疗程的效果.以停药时的检查结果为近期疗效.停药后随访1～4年的结果为远期疗效.结果两个剂量组共212例患者的平均近期疗效:治愈率为74.5%,有效率为99.1%,无效率为0.9%.平均远期疗效:治愈率为83.1%,有效率为89.3%,无效率为0.6%,复发率为10.2%.以12.5 mg/(kg@d)连续治疗9个月的疗效较好.复发病例再治疗的效果良好.结论阿苯达唑乳剂对肝囊型包虫病的临床疗效超过当前包虫病药物治疗的好水平,疗效稳定可靠,不良反应轻微,可成为治疗包虫病的首选药物.
关键词： 囊型包虫病/囊型棘球蚴病 细粒棘球绦虫 阿苯达唑乳剂 临床疗效 化学治疗 -
新疆生产建设兵团家犬和家畜细粒棘球绦虫感染情况调查
采用分层随机抽样法在新疆生产建设兵团13个棘球蚴病流行师开展家犬和家畜细粒棘球绦虫感染情况调查.用犬细粒棘球绦虫抗原检测试剂盒对5 391份犬粪进行检测,其中阳性粪样37份,犬粪抗原阳性率为0.69%.采用剖检和视触诊法在11个棘球蚴病流行师开展家畜调查,共调查家畜11 122头,阳性家畜431头,患病率为3.88％.
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细粒棘球绦虫EgA31重组蛋白的抗原表位分析预测
根据GenBank中细粒棘球绦虫EgA31序列(GenBank登录号为AF067807)设计引物,以细粒棘球绦虫mRNA为模板,RT-PCR扩增EgA31基因,将其克隆入pUCm-T载体,转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆,经BamH Ⅰ、SacⅠ双酶切和PCR鉴定,获得阳性重组质粒pUCm-T/EgA31,并将测序正确的片段连接表达载体,成功构建重组质粒pET30a-EgA31.经序列分析和同源性比较,以及对其编码产物进行B细胞和T细胞表位分析,结果表明PCR扩增的特异条带为636 bp,与预期相符,与GenBank已知基因序列同源性为100％.编码产物B细胞和T细胞联合表位预测,氨基酸区域可能在32～79、79～95、105～124和141～154位.
关键词： 细粒棘球绦虫 pET30a-EgA31 抗原表位 生物信息学 -
细粒棘球绦虫egG1Y162抗原基因的克隆及序列分析
根据多房棘球绦虫emY162基因序列设计引物,利用PCR以细粒棘球绦虫原头蚴和成虫的基因组DNA和cDNA为模板扩增egG1Y162基因,构建PUCm-T/egG1Y162和PUCm-T/egG1Y162 cDNA重组质粒,经PCR、酶切及测序后,进行序列分析.细粒棘球绦虫2个不同发育阶段均克隆出esG1Y162基因,从基凶组DNA和cDNA克隆得到的片段长度分别为1 680 bp和459 bp,登录号分刖为AB458258和AB458259.
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细粒棘球绦虫原头蚴和成虫发育调控基因Ras GTPase的克隆及序列分析
应用RT-PCR方法 分别从新疆株细粒棘球绦虫原头蚴和成虫中克隆出Eg Ras GTPase基因,分别命名为EgRas-pro(GenBank登录号为EU560397)和Eg Ras-adult(GenBank登录号为EU560398). 生物信息学分析表明两者cDNA长度均为552 bp,编码184个氨基酸,等电点(pI)为6.54,彼此间仅有2个碱基和1个氨基酸的差别.同源性比对分析结果 显示,Eg Ras-pro和Eg Ras-adult与多房棘球绦虫Ras(EmRas)基因的同源性分别高达98.4%和98.9%:与其他种类的寄生虫、酵母、果蝇及人类的Ras GTPase基因的同源性为53.9%～78.8%.进化树分析发现Eg Ras-pro和Eg Ras-adult与EmRas和血吸虫Ras(SmRas)相聚集.本研究首次从新疆株细粒棘球绦虫两个发育阶段(原头蚴和成虫)中克隆出Eg Ras GTPase基因,其序列具有较高的保守性.
关键词： 细粒棘球绦虫 Ras GTPase序列分析 -
囊性棘球蚴病免疫发病机制研究进展
本文从宿主对棘球蚴感染的先天性抵抗、早期免疫、包囊形成期免疫、影响CD4+T细胞分化因素、细胞因子在细粒棘球绦虫(Eg)感染中的作用、Eg感染与变态反应、Eg感染的逃避机制等7个方面进行了综述.
