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共刺激分子B7-2基因转染抑制乳腺癌生长和转移的实验研究
目的:研究B7-2基因转染乳腺癌细胞对人乳腺癌肺转移的影响.方法:设计B7-2内引物,在内引物的5'端引入XbaⅠ、KpnⅠ酶切位点;在基因组B7-2编码基因两端设计外引物.分离人外周血单个核细胞,孵育成簇后提取总RNA,通过RT得到DNA,分别以外引物和内引物PCR扩增出B7-2基因,PCR产物经双酶切装入真核载体pcDNA3.1(+)构建成重组质粒B7-2pcDNA3.1,对重组质粒进行扩增.将重组质粒和空载体转染MD-MBA-231细胞,用FITC anti-human B7-2 antibody标记两组转染细胞和原细胞,流式细胞检测B7-2表达.将B7-2基因转染乳腺癌MD-MBA-231细胞,将MD-MBA-231/B7-2、MD-MBA-231/pcDNA3.1和MD-MBA-231分别接种于BALB/c小鼠皮下,观察B7-2基因转染对肺转移的影响.结果:获得B7-2重组基因,重组基因转染组的B7-2表达阳性率比空载体组和原细胞组分别高出36.77%和51.88%,种植MD-MBA-231/B7细胞株的BALB/c小鼠成瘤率及肺转移率显著低于对照组,HE染色发现淋巴细胞广泛浸润于MD-MBA-231/B7种植的肿瘤及其肺转移灶.结论:B7-2基因通过提高免疫原性抑制乳腺癌的生长及肺转移.
关键词： B7-2 共刺激分子 MD-MBA-231 真核表达 -
过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞共刺激分子B7-1、B7-2与CD28的表达及意义
目的探讨免疫共刺激分子B7-1 、B7-2和CD28在过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及其意义.方法应用流式细胞仪(FCM)从蛋白质水平检测了38例过敏性紫癜(HSP)患儿(其中11例诊断为紫癜性肾炎)和20例正常儿童PBMC中B7-1 、B7-2 和CD28的表达,并分析其与24 h尿微量白蛋白的关系.结果过敏性紫癜患儿B7-2蛋白和CD28蛋白的表达水平(相对平均荧光强度,RMFI)均高于正常对照组(P＜0.05),各组间B7-1蛋白表达水平的差别无显著性意义(P＞0.05).18例24 h尿微量白蛋白(24h UMA)增高的HSP患儿共刺激分子B7-2、CD28蛋白的表达与24 h UMA呈等级正相关.结论过敏性紫癜患儿PBMC共刺激分子B7-2、CD28表达异常增加,可能参与HSP的起病,而且B7-2、CD28蛋白的表达与24 h尿微量白蛋白呈等级正相关,提示可以作为监测HSP患儿病情以及检测早期肾脏损害的免疫学指标.
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共刺激分子B7-2对小鼠肝癌治疗作用的实验研究
目的应用转染有小鼠B7-2基因片段的肝癌细胞,建立小鼠肝癌模型,观察小鼠肿瘤生长和消退情况,研究共刺激分子B7-2对肿瘤的免疫治疗作用.方法建立BALB/c小鼠转B7-2基因肝癌细胞株H22/B7-2,细胞计数法测定肿瘤细胞体外增殖能力;BALB/c鼠皮下接种H22/B7-2及野生型H22细胞H22/Wt,以空载体转染细胞H22/neo为对照,建立小鼠肝癌模型,观察小鼠成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节大小;同源淋巴细胞肿瘤细胞混合培养(MTLCs)后测定淋巴细胞增殖指数和CTLs活性,同时测定培养上清IL-2、IFNγ,研究B7-2分子的抗肿瘤免疫效果.结果细胞在体外增殖能力一致(P＝0.782);当接种不同肿瘤细胞后,三组动物都发生肿瘤,接种H22/B7-2组肿瘤形成有迟发性,并在接种18 d后肿瘤都开始缩小,但终不会完全消失;接种H22/Wt和H22/neo组动物肿瘤都开始缩小,但终不会完全消失;接种H22/Wt和H22/neo组动物肿瘤呈进行性生长.H22/B7-2在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导CTLs的能力明显强于对照细胞(P＜0.05).结论共刺激分子B7-2能增强肝癌细胞的免疫原性,它在抗肿瘤早期发挥作用.用其治疗肝癌是有效的,但不能介导完全和长期的抗肿瘤效应.
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妊娠期高血压疾病患者外周血共刺激分子B7-1和B7-2的研究
目的:研究妊娠期高血压疾病患者外周血单核细胞共刺激分子B7-1和B7-2的表达水平,探讨B7-1、B7-2在发病中的作用.方法:实验组为妊娠期高血压疾病患者60例(包括20例重度子痫前期患者,20例轻度子痫前期患者,20例妊娠期高血压患者);对照组为同期正常妊娠妇女20例,正常未孕妇女20例.分别采集、分离两组研究对象外周血单核细胞,用流式细胞术检测各组外周血单核细胞B7-1、B7-2的表达率.结果:(1)妊娠期高血压疾病患者B7-1表达率为9.49±2.66,显著高于正常妊娠组和正常未孕组(P＜0.05);(2)妊娠期高血压疾病患者B7-2表达率为20.00±4.93,显著低于正常妊娠组(P＜0.05);(3)重度子痫前期患者B7-1表达率为10.67±2.57,轻度子痫前期患者为10.14±2.31,显著高于妊娠期高血压患者(P＜0.05).结论:妊娠期高血压疾病患者外周血单核细胞共刺激分子B7-1、B7-2异常表达在其发病中有重要作用,可能是妊娠期高血压疾病发生的重要原因.
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小鼠B7-1和B7-2基因转染EL4细胞瘤苗抗肿瘤免疫作用的比较研究
目的:比较小鼠免疫共刺激信号B7-1和B7-2转化小鼠淋巴瘤细胞株EL4后,转化细胞介导的抗肿瘤免疫作用.方法:构建逆转录病毒表达载体pIXSN-mB7-1和pLXSN-mB7-2,转染野生型EL4细胞,获得高表达B7-1和B7-2分子的EL4/mB7-1和EL4/mB7-2细胞,并制备成瘤苗;分别应用LDH释放法、MTT法以及ELISA法检测比较两种瘤苗激活的T细胞的杀伤活性、细胞增殖和IL-2的分泌情况.结果:①EL4/mB7-1和EL4/mB7-2瘤苗刺激小鼠脾脏T淋巴细胞分泌IL-2的量明显超过野生型EL-4细胞(P＜0.01);②24h,EL4/mB7-1瘤苗刺激小鼠脾脏T淋巴细胞分泌的IL-2的量超过EL4/mB7-2瘤苗(P＜0.05);48 h,EL4/mB7-2瘤苗刺激小鼠脾脏T淋巴细胞分泌IL-2的量超过EL4/mB7-1瘤苗(P＜0.05);③EL4/mB7-1瘤苗和EL4/mB7-2瘤苗刺激小鼠T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的活性明显增强.EL4/mB7-2瘤苗刺激小鼠T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的活性与EL4/mB7-1瘤苗相当(P＞0.05).结论:mB7-1和mB7-2分子可活化T细胞分泌IL-2,两者刺激T细胞产生IL-2的高峰时间不同.mB7-2刺激T细胞产生CTL的杀伤活性与mB7-1无明显差别.
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B7-1、B7-2在牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的T淋巴细胞反应中的作用
目的：研究B7?1、B7?2分子对牙龈卟啉单胞菌（ Porphyromonas gingivalis，P． g）脂多糖诱导的T淋巴细胞反应的影响。方法：分别从基因敲除小鼠（ B7?1 KO组、B7?2 KO组、B7?1／2 KO组）和野生小鼠（ WT组）骨髓培养获得原代树突状细胞（ dendritic cell，DCs）并经P． g脂多糖刺激后，与T细胞混合培养。 CCK8试剂盒评价T细胞增殖，ELISA检测培养液中IFN?γ、IL?4及IL?17的水平，荧光定量PCR检测T细胞IFN?γ、IL?4、IL?17、GATA?3、T?bet及RORγt的转录水平。结果：CCK8检测显示各组T细胞增殖水平无差异。 ELISA及荧光定量PCR显示与WT组比较，B7?1 KO组IFN?γ降低，IL?4升高，IL?17无变化，T?bet降低，GATA?3升高，RORγt无变化；B7?2 KO组IFN?γ升高，IL?4降低，IL?17降低，T?bet升高，GATA?3降低，RORγt降低；B7?1／2 KO组各因子变化趋势介于B7?1 KO组和B7?2 KO组之间。结论：B7?1及B7?2分子对P． g脂多糖刺激的T细胞增殖无明显影响。但B7?1分子可促进T细胞向Th1型分化，抑制Th2型分化，与Th17型分化相关性不大；而B7?2分子抑制T细胞向Th1型分化，促进Th2型及Th17型分化。
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排斥反应时移植肾组织内共刺激分子B7-2和CD40的表达研究
目的 检测排斥反应时移植肾组织内B7-2和CD40的表达情况.方法 对同种异体移植肾患者行经皮肾穿刺活检术后(供肾修整结束时)、术后7 d、1个月、6个月、1年或以上,用免疫组化方法检测活检组织中B7-2和CD40的表达情况.结果 53例肾移植受体共行肾活检198次.B7-2阳性表达主要见于上皮细胞和炎性浸润细胞.移植后7 d阳性表达率显著上升,1个月后下降至术前水平;急性排斥反应(AR)时阳性表达率明显上升,抗排斥治疗1周后下降至术前水平;AR组的阳性表达率显著高于N-AR(非急性排斥反应)组.系膜细胞,肾小管上皮细胞和血管内皮细胞表达均阴性.CD40移植前表达阴性;移植后肾功能稳定期的穿刺标本中偶见弱阳性表达;AR时CD40表达增加,内皮细胞、上皮细胞和炎性浸润细胞的阳性率分别为21%、39%和60%,抗排斥治疗后CD40表达转阴性;N-AR组中CD40阳性表达率显著低于AR组.结论 共刺激分子B7-2和CD40的表达与急性排斥反应的发生密切相关.
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共刺激分子B7-2对小鼠肝癌治疗作用的实验研究
目的:应用转染有小鼠B7-2基因片段的肝癌细胞,建立小鼠肝癌模型,观察小鼠肿瘤生长和消退情况,研究共刺激分子B7-2对肿瘤的免疫治疗作用.方法:建立BALB/c小鼠转B7-2基因肝癌细胞株H22/B7-2,细胞计数法测定肿瘤细胞体外增殖能力;BALB/c鼠皮下接种H22/B7-2及野生型H22细胞H22/Wt,以空载体转染细胞H22/neo为对照,建立小鼠肝癌模型,观察小鼠成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节大小;同源淋巴细胞肿瘤细胞混合培养(MTLCs)后测定淋巴细胞增殖指数和CTLs活性,同时测定培养上清IL-2、IFNγ,研究B7-2分子的抗肿瘤免疫效果.结果:细胞在体外增殖能力一致(P＝0.782);当接种不同肿瘤细胞后,三组动物都发生肿瘤,接种H22/B7-2组肿瘤形成有迟发性,并在接种18d后肿瘤都开始缩小,但终不会完全消失;接种H22/Wt和H22/neo组动物肿瘤呈进行性生长.H22/B7-2在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导CTLs的能力明显强于对照细胞(P＜0.05).结论:共刺激分子B7-2能增强肝癌细胞的免疫原性,它在抗肿瘤早期发挥作用.用其治疗肝癌是有效的,但不能介导完全和长期的抗肿瘤效应.
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B7-2基因联合自杀基因治疗乳腺癌移植瘤模型
目的 观察树突状细胞活化抗原B7-2基因联合自杀基因系统EC-CD/5-FC于实验性乳腺癌的体、内外治疗的协同作用.方法 用重组腺病毒构建CD和B2-7载体,体外感染人乳腺癌MCF-7细胞,荧光显微镜观察其感染率.然后给与前药5-FC,通过MTT法检测MCF-7细胞的增殖情况;Annexi V-FTTC/PI双染流式细胞术检测MCF-7细胞的细胞周期.BALB/C小鼠腋窝下注射MCF-7细胞制备乳腺癌移植瘤模型,待肿瘤直径达0.5 cm大小,分别在肿瘤局部直接注射AdCD/B7-2,然后连续10 d腹腔注射5-氟胞嘧啶(5-FC),免疫组化法检测肿瘤组织中CD8+T表达.结果 MTI法检测显示MCF-7细胞对前药有较高的敏感性,AdCD/5-FC/AdB7-2和AdCD/5-FC组MCF-7细胞的增殖均受到明显抑制(P＜0.05);而AdB7-2治疗基因对MCF-7细胞的增殖没有任何影响.在感染复数为100时流式细胞仪检测,AdCD/5-FC/Ad-B7-2组和AdCD/5-FC组均出现典型的凋亡峰,细胞周期分析显示治疗后G0～G1期比率增多,G2～M及S期细胞减少.在MCF-7移植瘤模型中,AdCD/5-FC/Ad-B7-2治疗后移植瘤的生长明显受到抑制;肿瘤瘤体内或瘤体周围CD8+T细胞浸润增加.结论 B7-2联合自杀基因系统对乳腺癌MCF-7细胞及其MCF-7细胞移植瘤均有明显的抑制作用,B7-2联合自杀基因AdCD/5-FC系统时,共刺激分子B7-2可通过增强和诱导的特异抗肿瘤免疫,有效减少肿瘤负荷,增强Ad-CD/5-FC系统对肿瘤的杀伤作用.
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狼疮性肾炎外周血单个核细胞B7-1和B7-2 mRNA表达异常及其与疾病活动的关系
目的:观察活动期和静止期狼疮肾炎(LN)外周血单个核细胞(PBMC)B7-1(CD80)和B7-2(CD86)mRNA表达及其与疾病活动的关系,以探讨B7-1和B7-2 mRNA表达异常在LN自身免疫发生中的作用及临床意义.方法:以正常人为对照,分离15例活动期和13例静止期的LN患者PBMC,采用半定量反转录PCR的方法,检测PB-MC的B7-1和B7-2 mRNA表达.B7-1和B7-2 mRNA表达与SLE疾病活动评分指数(SLEDAI)的相关关系用直线相关分析.结果:静止期LN组B7-1和B7-2 mRNA表达与正常人对照组相比无显著性差异(P＞0.05),活动期LN组B7-1 mRNA有明显的上升(P＜0.05),B7-2 mRNA表达增高更加显著(P＜0.01).B7-2 mRNA的增高与SLEDAI呈直线正相关关系(r＝0.8641,P＜0.05).结论:活动期狼疮性肾炎存在着B7mRNA表达的异常,B7-2mRNA的增高与SLEDAI呈直线正相关关系.
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金黄色葡萄球菌肠毒素B对皮肤组织中细胞表面分子表达的影响
目的:探讨金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对体外培养皮肤组织中细胞表面分子ICAM-1(CD54)和B7-2(CD86)表达的影响.方法:分别将来自整形术9例胸部皮肤组织切成面积相同的小组织块,每人份等量分为实验组及对照组.实验组SEB适当浓度施于皮肤表面,对照组PBS同法处理皮肤组织,然后将皮肤组织培养24 h后快速组织切片,免疫组化(LSAB法)观察SEB刺激后皮肤组织中表皮角质形成细胞表面ICAM-1分子和郎格汉斯细胞表面B7-2分子的表达.结果:实验组表皮角质形成细胞表面分子ICAM-1和郎格汉斯细胞表面分子B7-2均表达显著高于对照组(P＜0.01,P＜0.05).结论:SEB可刺激体外培养皮肤组织的表皮细胞高表达ICAM-1分子和B7-2分子.
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B7-2对肝细胞癌特异性免疫的影响
T细胞的激活需要两种信号刺激,第二信号为非抗原特异性,主要由协同刺激分子B7家族介导产生.我们将B7-2真核表达载体转染高度表达组织相容性复合物Ⅰ(MHC-Ⅱ)分子而缺乏MHC-Ⅱ分子的肝癌细胞株HMC7721,观察B7-2对CD8+T细胞分化和肿瘤特异性免疫的影响.
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B7家族新成员PD-L1、PD-L2的研究进展
"协同刺激信号"是1970年由Bretscher和Cohn在T细胞活化双信号模型的基础上提出的[1],即除了通过APC递呈MHC处理过的抗原给抗原特异性T细胞提供第1信号外,还需协同刺激分子作为辅助信号的协同作用,达到生理活化阈值后才能使T细胞产生正常的免疫应答,从而在理论上更好地解释了免疫系统对自身和非自身抗原不同识别的调节机制.如果缺少共刺激分子的第2信号,将会导致调节性 T细胞的无反应性或特异性免疫耐受[2].
