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成年裸鼠与野生型小鼠皮肤形态结构及表皮干细胞标志物分布、表达量的比较研究
目的 比较成年裸鼠与野生型小鼠皮肤形态结构及表皮干细胞标志物p63、角蛋白19和β1整合素的分布和表达量的差异,为后续的皮肤组织工程学研究提供客观的参照.方法 分别取8只成年裸鼠与野生型小鼠背部皮肤,制作石蜡切片,进行HE染色,光镜下观察皮肤表皮、真皮和皮肤附属器的形态结构;免疫组织化学法检测p63、角蛋白19和β1整合素在两种鼠皮肤的分布和表达量.结果 HE染色低倍镜下裸鼠表皮较野生型小鼠厚,高倍镜下裸鼠表皮由3～4层上皮细胞组成,而野生型小鼠表皮由1～2层上皮细胞组成.裸鼠表皮基底层细胞呈立方形或者矮柱形,细胞核深染,呈卵圆形,居中,野生型小鼠表皮基底层细胞呈立方形,细胞核圆形深染.裸鼠表皮有明显的颗粒层,而野生型小鼠表皮则无.裸鼠皮脂腺没有野生型小鼠皮脂腺发达;免疫组织化学显示p63表达于裸鼠和野生型小鼠毛囊和表皮基底层细胞的胞核中,角蛋白19表达于裸鼠和野生型小鼠皮肤毛囊和基底层细胞中,β1整合素表达于裸鼠皮肤毛囊和表皮颗粒层细胞中及野生型小鼠毛囊中;裸鼠p63、β1整合素和角蛋白19的表达量少于野生型小鼠,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 成年裸鼠与野生型小鼠皮肤形态结构及表皮干细胞标志物的分布和表达量存在差异,可以作为区别裸鼠与野生型小鼠皮肤的参考.
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碱性成纤维细胞因子对SD大鼠表皮干细胞分化为神经干细胞的影响
目的 研究碱性成纤维细胞因子(bFGF)对大鼠表皮干细胞分化为神经细胞的影响.方法 分离获得饲养了1～3天的新生SD大鼠表皮基底层组织,利用10 min快速贴壁法消化、分离获得表皮干细胞,于倒置显微镜下观察表皮干细胞的形态.培养表皮干细胞的培养基为K-SFM,然后按照不同密度表皮干细胞进行分组处理(0.1×107/mL,0.3×107/mL,0.5×107/mL,0.1×106/mL),每组加入20 ng/mL的bFGF,利用细胞免疫组织化学法检测细胞标志物Nestin和NSE的变化,以及观察细胞形态发生的变化.结果 成功分离得到SD大鼠表皮干细胞;bFGF诱导后,0.3×107/mL组和0.1×107/mL组细胞第3天即可见细胞开始伸展生长,在约1周时细胞开始分化成神经细胞;且在细胞形态发生双极化改变的数目趋势上也具有一致性;Nestin和NSE检测均呈阳性表达.结论 bFGF有助于诱导表皮干细胞向神经细胞的分化,而且该诱导作用具有一定的细胞密度依赖性.
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表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤促进创面愈合的实验研究
目的 探讨表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤促进创面愈合的可行性.方法 (1)用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,用Ⅳ型胶原快速黏附法分离、纯化人表皮干细胞,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液等组成人表皮干细胞培养基进行体外培养,测定克隆形成率.(2)将培养人表皮干细胞接种于制备的脱细胞真皮支架中,构建组织工程人工皮肤,移植治疗兔全层皮肤缺损创面,观察创面修复效果.(3)取新西兰白兔常规制作背部全层皮肤缺损创面,随机分为4组:A、B、C组分别用含表皮干细胞的组织工程皮肤、含角质细胞的组织工程皮肤和单纯脱细胞真皮移植于皮肤缺损创面;D组用创面空置为对照.观察创面修复情况、局部炎症反应,并记录创面愈合时间.结果 体外培养的人表皮干细胞增殖稳定,克隆形成率明显高于角质细胞对照组(P＜0.05).移植后A组创面愈合良好,局部炎症反应轻微,无出血、积脓、坏死,创面愈合时间较B、C、D组明显缩短(P＜0.05或P＜0.01).结论 以表皮干细胞作为种子细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤可用于皮肤缺损创面的修复治疗.
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应用表皮干细胞、间充质干细胞构建复合皮肤及移植实验
目的 探讨应用表皮干细胞、间充质干细胞构建复合皮肤修复全层缺损皮肤的可行性.方法 选择新西兰大白兔18只,在每只兔背上用常规手术方法切去3个大小相同的全层皮肤缺损创面,面积约2 cm×2 cm.将经处理的脱细胞真皮(acellular dermal matrix,ADM)接种骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)和表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)制成复合皮肤.实验分A、B、C3组,A组移植复合皮肤;B组移植脱细胞真皮;C组用油纱布敷盖创面.观察各组移植后1～3周内创面愈合、肉芽组织生长及上皮化等情况,并进行创面组织HE染色.结果 术后A、B、C3组创面愈合时间分别为(14.6±1.1)、(18.3±1.2)、(23.0±1.4)d,组间比较差异有统计学意义(P<0.05).术后14 d创面标本HE染色观察:A组创面已上皮化,毛细血管、成纤维细胞数量增加,胶原合成增多,肉芽组织形成丰富;B、C组创面上皮化不全,仍可见许多炎性细胞,肉芽组织中毛细血管、成纤维细胞数量不如A组.结论 表皮干细胞、间充质干细胞接种于脱细胞真皮构建复合皮肤,可加速新生血管形成及创面上皮化,可用于全层皮肤缺损创面的治疗,提高创面愈合质量.
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表皮干细胞及其在烧伤创面的应用前景
创面愈合问题对于烧伤来讲,早期主要是封闭创面,防治感染和挽救生命;后期主要是防治瘢痕过度增生,提高生活质量.因此,大面积烧伤后迅速采取有效的方法,恰当使用理想的材料封闭创面,成了挽救患者生命、减少器官功能损害、提高患者生存质量,极其重要的措施,也是长期以来国内外烧伤工作者梦寐以求的目标.近三十年,随着细胞生物学、分子生物学技术、组织工程学的快速发展,探寻组织工程化皮肤创面覆盖物的"种子细胞"的研究又趋活跃.1975年Rheinwald等建立了表皮细胞体外培养技术;1981年O'Conner等首次将培养的人自体表皮细胞膜片用于烧伤创面覆盖;1984年Gallico等首例报道了培养自体表皮细胞膜片在大面积深度烧伤治疗中的成功应用,开拓了烧伤治疗的新时代.
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表皮干细胞的生物学行为研究进展
皮肤是人体大的器官,在维持机体内环境稳态起着重要的作用.大面积深度烧伤等各种原因所致的皮肤损伤均需足够的皮肤进行修复.虽然目前临床上使用自体皮移植、异体皮/异种皮移植术和人工替代物等解决了部分问题,但对大面积烧伤患者即使覆盖了创面,仍存在所覆盖创面的皮肤菲薄、柔韧性差、机械强度低等缺陷,特别是许多植入的替代物创面瘢痕修复后,其不能排泄汗液、分泌皮脂等不同程度的功能障碍.因此,如何加速与促进受损皮肤的修复和功能的重建已成为组织修复领域的重大问题.随着组织工程学的不断发展,干细胞疗法已成为组织再生和修复研究的新策略;因此,了解表皮干细胞生物学行为,对于促进皮肤功能和结构的生理性修复具有重大的意义.现就其某些研究进展综述如下.
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人表皮干细胞体外分离和培养的研究
目的建立人表皮干细胞体外分离和培养的技术方法.方法用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法分离出角朊细胞和成纤维细胞,并以人成纤维细胞条件培养基为基础制备表皮干细胞培养液,用以人表皮干细胞(Ⅳ型胶原快速粘附法富集分离)的体外培养,通过检测β1整合素和角蛋白19的表达水平及其克隆形成率和克隆维持时间对其进行鉴定,角朊细胞作对照.结果表皮干细胞体外培养,可见细胞呈克隆样生长、β1整合素及角蛋白19免疫组织化学染色呈阳性,且其克隆形成率和克隆维持时间分别为(17.04±1.01%)和15～18d,明显高于对照组的(8.72±0.73%)和9～10d(P＜0.01).结论应用Ⅳ型胶原快速粘附法及人成纤维细胞条件培养基,对人表皮干细胞成功进行了体外分离和培养,为表皮干细胞体外的大量扩增奠定了基础.
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表皮干细胞在烧伤创面修复中的作用研究进展
表皮干细胞具有无限增殖和分化的潜能,是皮肤及其附属器发生、修复、重塑的基础.近年来,表皮干细胞的研究已引起国内外越来越多的关注.本文从干细胞,表皮干细胞的概念、特征、来源、分布及在烧伤创伤修复中表皮干细胞的分布特征等方面探讨表皮干细胞在创面修复中的作用研究进展.
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人表皮细胞中侧群细胞表型的初步分析
目的:检测人表皮细胞中是否存在侧群(side population,SP)细胞,并研究该表型细胞是否表达通用干细胞标志物ABCG2和表皮干细胞的标志物整合素α6和β1.方法:运用中性蛋白酶和胰蛋白酶两步消化法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮细胞.经Hoechst33342荧光染料和PI染色,流式细胞仪分析并分选SP细胞.采用流式细胞仪分析SP细胞ABCG2、整合素α6和β1的表达情况.结果:人表皮细胞中存在SP细胞,其比例为0.2%～0.3%.用流式细胞仪可检测到在SP细胞以及总表皮细胞中均有少量细胞表达通用干细胞标志物ABCG2以及表皮干细胞的标志物整合素α6和β1,但二者阳性细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05).结论:表皮细胞中的SP细胞是否是富集的表皮干细胞仍存在疑问,还需要进一步的动物体内移植实验、克隆形成能力和增殖能力的研究证实.
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表皮干细胞及其微环境研究进展
表皮干细胞是皮肤重要的干细胞之一,主要位于毛囊隆突部,表面具有多种标记物.表皮干细胞生长于特定微环境niche中,有多种细胞因子、信号通路参与了niche调节表皮干细胞归巢、自我更新和分化,参与皮肤创伤修复、皮肤肿瘤形成等多种功能.对表皮干细胞及其微环境niche的深入研究,对了解表皮发育、表皮肿瘤形成及组织工程有着重要的意义.
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hTERT基因转染人表皮干细胞的可行性研究
目的 观察外源性人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因转染体外培养的人表皮干细胞的可行性.方法 采用脂质体转染法,将质粒pIRES2-EGFP-hTERT转入体外培养的人表皮干细胞,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选与培养.应用RT-PCR法和Western blot法检测hTERT mRNA及其蛋白的表达.结果 转染组hTERT mRNA及其蛋白的表达强于非转染组.结论 外源性hTERT基因转染体外培养的人表皮干细胞具有可行性.
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糖尿病大鼠表皮组织表皮干细胞的β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6表达变化
目的 观察糖尿病(DM)大鼠表皮组织表皮干细胞(ESCs)中β-连环素(β-catenin)、周期蛋白D1(Cyclin D1)、Wnt通路蛋白1(Wnt-1)、细胞角蛋白K6表达变化,探讨DM大鼠ESCs结构和功能变化的机制.方法 将30只大鼠随机分为观察组和对照组,各15例.观察组用链脲佐菌素法制作DM模型,对照组常规饲养.造模成功28 d后取两组大鼠表皮组织,分离ESCs,采用免疫组化SP法测算两组ESCs的β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6阳性表达率和β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6阳性染色积分光密度值(IA).结果 观察组大鼠表皮组织ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6阳性表达率分别为15.07%、16.89%、15.51%、14.67%,对照组分别为72.04%、68.91%、65.08%、57.13%,两组大鼠表皮组织ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6阳性表达率相比P均<0.05.观察组大鼠表皮组织ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6阳性染色IA分别为74.41±6.17、68.25±5.79、31.67±6.09、60.54±26.72,对照组分别为117.34±10.05、109.45±7.67、72.42±7.98、125.54±30.14,两组大鼠表皮组织ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6阳性染色IA相比P均<0.05.结论 DM大鼠表皮组织ESCs中β-catenin、CyclinD1、Wnt-1、K6表达降低,这可能是DM大鼠ESCs结构和功能变化的机制.
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自体表皮干细胞修复先天性巨痣的临床疗效
目的 探讨自体表皮干细胞移植治疗先天性巨痣的临床效果.方法取自体血分离表皮细胞并培养表皮细胞膜片,切除巨痣后植于创面,抗生素预防感染.结果 所有移植膜片全部成活,术后外观好、瘢痕少,术后远期效果显著.结论自体表皮干细胞移植是治疗先天性巨痣的良好方法.
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自体表皮干细胞修复巨痣的临床观察
目的 探讨自体表皮干细胞移植治疗先天性巨痣的临床效果.方法 取自体血分离表皮细胞并培养表皮细胞膜片,削除巨痣后植于创面,抗生素预防感染.结果 所有移植膜片全部成活,术后外观好、瘢痕少,术后远期效果显著.结论 自体表皮干细胞移植是治疗先天性巨痣的良好方法.
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蜕皮甾酮对人表皮干细胞体外增殖的影响
目的 观察蜕皮甾酮(EDS)对人表皮干细胞(hESCs)体外增殖的影响.方法 采用中性蛋白酶-Ⅳ型胶原黏附法分离正常人包皮表皮干细胞,免疫细胞化学法检测第3代细胞β1整合素、角蛋白19(CK19)、角蛋白14(CK14)及角蛋白10(CK10)的表达以鉴定hESCs.分别用含0 mg·L-1(对照组)、10 mg·L-1(10 mg·L-1组)、20 mg·L-1(20 mg·L-1组)、40 mg·L-1(40 mg·L-1组)、80mg·L-1(80 mg·L-1组)及160 mg·L-1(160 mg·L-1组)EDS的Epilife培养基作用第3代hESCs 3 d,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测酶标仪490 nm下的吸光度值,评价EDS对hESCs体外增殖的影响.结果 免疫细胞化学法检测提示第3代表皮干细胞B1整合素、CK 19、CK 14的表达阳性,CK 10表达阴性.EDS作用3 d后,10 nag·L-1组、20 nag·L-1组、40 nag·L-1组、80 mg·L-1组及160 mg·L-1组吸光度均高于对照组(P＜0.05);40 mg·L-1组、80 mg·L-1组和160 mg·L-1组吸光度均高于10 mg·L-1组和20 mg·L-1组(P＜0.05);80 mg·L-1组吸光度高于40 mg·L-1组和160 mg·L-1组(P＜0.05);其余各组间两两比较无统计学差异(P＞0.05).结论 体外培养条件下EDS能促进hESCs增殖,该作用在EDS浓度为80 mg·L-1时为显著.
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表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复糖尿病难愈创面的可行性分析
目的 对表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复糖尿病难愈创面的可行性进行分析和探讨.方法 选取60只体质量250 ～300 g的雄性SD大鼠,建立糖尿病SD大鼠创面模型,分离培养大鼠皮肤表皮干细胞(ESCs),使用5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)对其进行标记.使用随机数表法将大鼠分为A、B、C组,A组大鼠皮肤创面接受羊膜负载BrdU标记的ESCs组织工程皮胶移植;B组大鼠皮肤创面接受羊膜移植;C组大鼠皮肤创面不接受处理.观察3组大鼠皮肤创面的愈合情况.结果 A组大鼠治疗7、14 d后的PCNA阳性细胞积分光密度平均值以及创面愈合率均高于B、C组,差异有统计学意义(P ＜0.05).结论 表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复糖尿病难愈创面安全可行.
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不同频率低强度电磁场促表皮干细胞分化机制初探
目的 观察不同频率低强度电磁场对表皮干细胞(EpSCs)分化的影响,并从基因水平初步探讨其调控机制.方法 取SD大鼠乳鼠背部皮肤组织,通过体外分离培养获取第2代EpSCs,将其分为3个磁刺激组及对照组,各磁刺激组细胞分别给予15,50及75 Hz,5 mT电磁场干预,对照组细胞未给予电磁场刺激.于实验进行10 d后对各组细胞进行免疫荧光检测以了解细胞分化情况,同时采用RT-PCR技术检测各组细胞c-myc、β-连环蛋白(β-catenin) mRNA基因表达,应用免疫组化方法检测各组细胞角蛋白18 (CK18)表达情况.结果 不同频率低强度电磁场刺激均能促进EpSCs分化,各磁刺激组细胞分化相关角蛋白(即CK18)表达均为阳性,并以50 Hz磁刺激组CK18阳性表达尤为显著.各磁刺激组c-myc mRNA表达(15,50及75 Hz磁刺激组c-myc mRNA吸光度值分别为27324,37037及24790)均较对照组增强(对照组c-myc mRNA吸光度值为19037) (P ＜0.01),且以50 Hz磁刺激组上调幅度较显著(P＜0.05).β-catenin mRNA表达(15,50及75 Hz磁刺激组β-catenin mRNA吸光度值分别为23199,22385及15688)则较对照组(对照组β-catenin mRNA吸光度值为30591)减低(P＜0.05).结论 15,50及75 Hz,5 mT电磁场刺激均能促进EpSCs分化,并以50 Hz,5 mT电磁场对EpSCs的促分化作用较显著,其调控机制可能与增强细胞c-myc表达、抑制β-catenin表达有关.
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低频电磁场对两种不同支架培养的表皮干细胞增殖的影响
目的 观察低频电磁场(LFEMF)对三维环境中培养的人表皮干细胞(ESCs)增殖的影响，为LFEMF用于皮肤组织工程提供实验依据。方法 取人包皮来源的ESCs作为种子细胞，利用Ⅳ型胶原快速贴壁法体外分离纯化ESCs，并种植于胶原海绵和壳聚糖支架材料，外加LFEMF治疗仪（场强5 mT，频率分别为1 Hz、10 Hz和50 Hz）刺激ESCs(30 min/d)，用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测支架材料细胞毒性，通过肉眼、HE染色后DAPI荧光核染色后镜下观察及扫描电镜观察ESCs生长情况，并收集培养2，7，10,14 d ESCs的DAPI核荧光染色数据，用显微图像软件分析细胞增殖数目，比较各时间点细胞增殖的区别。结果 LFEMF促进ESCs增殖的作用在不同频率组间的差异和两种支架上培养的ESCs增殖情况的差异均有统计学意义(P＜0.01)，10 d后胶原海绵支架上细胞增殖较壳聚糖支架上的细胞明显(P＜0.05)，各频率组LFEMF刺激均能促进ESCs增殖，频率不同，促增殖的效应不一(P ＜0.05)。结论 胶原海绵可较好地作为体外培养ESCs的支架，在LFEMF干预下可实现ESCs体外三维环境中较快扩增，LFEMF在皮肤组织工程中具有较大应用潜力。
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低强度电磁场促进鼠表皮干细胞移植修复皮肤缺损的实验研究
目的 观察低强度电磁场(LIEMF)在促进表皮干细胞(ESCs)移植修复皮肤缺损中的作用.方法 取7～8周龄的裸鼠50只,制作全层皮肤缺损后根据随机数字表随机分为3个实验组(1 Hz组、10 Hz组和50 Hz组)和2个对照组(细胞悬液对照组和空白对照组),每组10只.3个实验组和细胞悬液对照组利用胶原海绵将体外分离培养的人包皮来源的ESCs植入裸鼠创面,实验组外加LIEMF(磁感应强度5 mT,频率分别为1 Hz、10 Hz和50 Hz)刺激15 d(每日1次,每次30 min);空白对照组置于同等条件下不加细胞悬液和电磁场.通过计算创面收缩率,光镜下观察组织切片HE染色和免疫组织化学染色结果,以及透射电镜下观察再生皮肤组织内部结构,评定皮肤缺损修复情况.结果 ESCs可以在裸鼠皮肤缺损处成功生长,再生表皮层中有人β1整合素强阳性表达,并且实验组创面收缩率均高于对照组(P＜0.05).光镜和电镜下观察到,LIEMF干预后,各实验组再生皮肤具备完整的表皮层和真皮层,细胞层次增多,表皮层明显增厚,附件丰富,表皮细胞间有桥粒、半桥粒、粗张力微丝.结论 LIEMF可以促进移植了人表皮干细胞的裸鼠全层皮肤缺损创面愈合.
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不同频率低强度脉冲电磁场对表皮干细胞增殖的影响
目的 观察不同频率的低强度脉冲电磁场(LIPEMF)对皮肤表皮干细胞(ESC)增殖作用的影响.方法 取人包皮皮片体外分离培养的第2代ESC,分为对照组与LIPEMF组,LIPEMF组又根据不同刺激频率分为1,10和50 Hz组.对各组细胞进行细胞克隆计数,计算克隆形成率(CFE),采用MTT法检测细胞增殖水平.结果 不同频率LIPEMF的刺激均能促进ESC增殖,频率不同,促增殖效应不一,50 Hz组作用效果为明显,与对照组比较,生长曲线明显上移.ESCβ1整合素和角蛋白19染色结果呈阳性.不同频率的LIPEMF组ESC的CFE明显高于对照组(P＜0.01),50 Hz组的细胞CFE明显高于1 Hz组和10 Hz组(P＜0.01).结论 LIPEMF能明显促进ESC增殖,频率是影响ESC增殖的重要因素之一.
