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ERK信号通路对人表皮干细胞增殖分化的影响
背景：表皮干细胞体外培养时易于分化和衰老，增殖能力有限，制约了其在皮肤组织工程的应用和发展，了解表皮干细胞增殖分化的调控机制可以为表皮干细胞的临床应用奠定理论基础。
目的：探索ERK信号通路在人表皮干细胞增殖分化中的作用。
方法：分离培养表皮干细胞，使用ERK通路抑制剂PD98059抑制表皮干细胞ERK通路的活性，转染MEK1重组质粒过表达MEK1或者使用PMA激活ERK通路。通过MTT法检测表皮干细胞的增殖率，克隆形成实验检测表皮干细胞的克隆形成能力，Western blot检测表皮干细胞标志蛋白K19和β1-整合素及分化细胞标志蛋白K10的表达。
结果与结论：①使用PD98059抑制ERK通路后，表皮干细胞增殖率下降，克隆形成减少，细胞分化加强；②过表达MEK1或者使用PMA激活ERK通路后，表皮干细胞增殖率上升，克隆形成能力增强，细胞分化受到抑制；③这些结果表明ERK通路在表皮干细胞的增殖分化中有重要的作用。 -
利用载有角质细胞生长因子微囊的组织工程皮肤修复裸鼠皮肤缺损
背景：组织工程皮肤作为一项新兴技术拥有良好的应用前景。有研究表明，角质细胞生长因子可以促进表皮细胞增殖。目的：观察荷载角质细胞生长因子纳米微囊的新型组织工程皮肤修复裸鼠皮肤缺损的效果和特点。方法：构建荷载角质细胞生长因子的脱细胞真皮基质复合物；将人表皮干细胞群和成纤维细胞分离、培养，并且进行鉴定；将表皮干细胞群接种于复合物之上，观察其生长状况；将荷载角质细胞生长因子纳米微囊的组织工程皮肤移植于裸鼠皮肤缺损处，将无角质细胞生长因子纳米微囊的组织工程皮肤作为空白组，将其自体皮肤移植修复缺损组作为对照组，于移植后2，4，6周时观察皮片挛缩及组织学愈合情况，并应用抗人角蛋白10及β1-整合素免疫荧光检测修复区表皮和真皮层细胞来源、分化及生长情况。结果与结论：表皮干细胞在复合物表面生长良好，黏贴紧密，可见有连接成片趋势的小圆形的表皮干细胞及多角形的终末表皮细胞，部分形成克隆团块。移植后第2，4，6周，荷载角质细胞生长因子纳米微囊组织工程皮肤修复裸鼠皮肤缺损的结果均优于空白组及对照组，移植的皮肤边缘与邻近皮肤完全融合，但存在一定程度的挛缩。修复区组织工程皮肤的表皮细胞分层良好并能产生角质层，同时，移植后8，10周，组织工程皮肤切片免疫荧光染色可以鉴别出少量β1-整合素阳性细胞，均为表皮干细胞或短暂扩充细胞。结果证实，荷载角质细胞生长因子纳米胶囊的新型组织工程皮肤修复裸鼠皮肤缺损的效果较好，优于普通组织工程皮肤及自体全厚皮片移植修复。
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不同发育阶段人皮肤表皮干细胞增殖分化相关基因的表达特征
背景:目前研究认为表皮干细胞数量及增殖分化潜能的差异,可能是创面愈合能力随年龄增大而逐渐降低的重要原因之一.目的:探讨不同发育阶段人皮肤表皮干细胞β1整合素、角蛋白19、p63转录因子和端粒酶反转录酶的表达特征.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2005-09/2007-04在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成.材料:流产胎儿皮肤标本由南昌大学第一附属医院产科提供,4～12周岁少儿、25～45岁成人烧伤整形植皮手术剩余皮片标本由南昌大学第一附属医院烧伤科提供.方法:标本取材后立即用中性甲醛固定,常规石蜡包埋,4℃保存.所有标本经系列切片后,分别采用鼠抗人角蛋白19、β1整合素、p63转录因子、端粒酶反转录酶单克隆抗体作为一抗,以免疫组织化学EnVision法检测皮肤组织中表皮干细胞标志物的表达.主要观察指标:200倍光镜下观察免疫组化染色结果,测定表皮干细胞标志物阳性表达率.结果:胎儿皮肤、少儿皮肤和成人皮肤表皮的基底部、毛囊周围细胞β1整合素、角蛋白19、p63和端粒酶反转录酶均呈棕黄色阳性表达.胎儿表皮基底层细胞β1整合素、角蛋白19和p63均呈强阳性表达:少儿表皮基底层细胞中大部分表达β1整合素、角蛋白19和p63,阳性细胞均匀分布;成人表皮基底层细胞β1整合素、角蛋白19和p63呈弱阳性表达,阳性细胞散在分布;胎儿表皮基底层端粒酶反转录酶阳性细胞表达强度>少儿表皮>成人表皮.随年龄的增加,β1整合素、角蛋白19、p63和端粒酶反转录酶在胎儿、少儿、成人皮肤组织中的阳性表达率呈下降趋势(F=5.06,P＜0.01).结论:胎儿皮肤、少儿皮肤和成人皮肤表皮干细胞主要位于表皮基底层,端粒酶表达阳性区域及信号强度与表皮干细胞的定位分布及阳性表达强度相一致.提示表皮干细胞的数量、端粒酶活性表达的强弱可能与不同发育阶段皮肤组织的修复能力差异密切相关.
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表皮干细胞的定向分化:隆突激活假说的新认识
0 引言自1990年孙司天等提出毛囊干细胞定位于毛囊的隆突部--立毛肌的附着点处,即隆突激活假说,为表皮干细胞的研究奠定了坚实的理论基础.
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山羊胚胎皮肤的发育及β1整合素在发育中的表达
目的:观察山羊胚胎皮肤发育的过程以及在此过程中表皮干细胞的特异性标志β1整合素的表达状况,以定位表皮干细胞.方法:实验于2006-11/2007-05在两北农林科技大学动物科技学院组织胚胎学实验室完成.取8～18周龄山羊胚胎背部皮肤,用组织学方法,观察山羊胚胎皮肤发育的形态学变化;用免疫组织化学SP法,观察β1整合素在山羊胚胎皮肤发育过程中的表达特征.结果:①表皮于8～9周龄时开始发育,10周龄时表皮由二层细胞构成,在11周龄时可见有原始毛囊的出现,有少量张力原纤维的存在,并发现朗格罕斯细胞,12～13周龄时表皮细胞出现角化层、透明层及颗粒层的分化,可见汗腺,14～15周龄毛球上皮细胞索开始分化为外根鞘、内根鞘的原基和毛发的前体,在毛囊一旁出现皮脂腺,张力原纤维增多、变粗,并发现典型的桥粒结构,16～17周龄时表皮层变薄,毛开始形成,并随着发育逐渐长出体表.18周龄皮肤的结构渐趋成熟.②胚胎发育早期,基底层细胞胞浆内表达β1整合素,随着皮肤发育,β1整合素阳性细胞出现在毛囊隆突区和外根鞘.结论:①山羊胚胎表皮的发生优先于真皮的发生,在胚胎时期处于剧烈的分化阶段.②β1整合素的阳性反应定位于基底层,随着皮肤的发育也表达于毛囊隆突区和外根鞘,表皮干细胞的数量和分布的部位与皮肤的发育特点有关系.
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人表皮干细胞的体外分离和培养
背景:如何获得高纯度的表皮干细胞以及维持其干细胞表型和体外增殖特性,是目前表皮干细胞体外培养过程中急需解决的问题.目的:建立人表皮干细胞体外分离和培养的技术方法.设计、时间及地点:细胞观察,于2005-03/2006-05在南昌大学第一附属医院?汉烧伤科完成.材料:所用包皮来自2～12岁行包皮环切术的患者,患者无泌尿系统感染等疾病.方法:取包皮皮片,采用Dispase Ⅱ酶和胰蛋白酶两步法分离出角朊细胞和成纤维细胞,Ⅳ型胶原快速黏附法富集分离表皮干细胞.收集处于指数牛长期第二三代成纤维细胞的上清液,过滤后与角朊细胞无血清培养基等比例混合,并加入胎牛血清、表皮生长因子、牛垂体提取物等组成表皮干细胞培养液,用以人表皮十细胞的体外扩增培养,以角朊细胞作对照.主要观察指标:传至第2代,通过平板克隆形成实验计算克隆形成率和克隆维持时间,采用免疫组织化学染色检测β1整合素和角蛋白19的表达.结果:①与同一标本同一批次培养的角朊细胞相比,人表皮干细胞的克隆形成率明显升高,克隆维持时间延长(P＜0.01).②表皮干细胞β 1整合素及角蛋白19免疫组织化学染色均呈阻性.结论:应用Ⅳ型胶原快速黏附法及人成纤维细胞条件培养基,对人表皮干细胞成功进行了体外分离和培养.
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表皮干细胞和真皮干细胞的概念定位及其标记物的研究进展
成体干细胞(adult stem cell)是一类存在于所有能自我更新的组织中的原始细胞,具有终身、无限的自我更新能力,能够产生至少一种以上高度分化的子代细胞,并在细胞的生长和分化过程中起着主导作用.
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血小板衍生生长因子对表皮干细胞增殖与迁移能力的影响
目的 探讨PDG对表皮干细胞增殖与迁移能力的影响.方法 从提供者皮肤组织中分离表皮干细胞,并采用免疫组化的方法对表皮干细胞指标分子CK19与β1整合素进行鉴定;将PDGF干预表皮干细胞后,采用MTT法检测细胞增殖情况;采用流式细胞术检测细胞周期;采用Transwell小室实验检测细胞迁移;采用WB检测PCNA蛋白的表达水平.结果 分离的表皮干细胞中CK19与β1整合素呈阳性表达;PDGF作用于表皮干细胞后,细胞增殖率显著上调,细胞周期从G1期进入S期明显缩短,细胞迁移能力增强.结论 PDGF能够促进表皮干细胞的细胞增殖与细胞迁移能力.
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眼睑Merkel细胞癌一例
Merkel细胞癌是原发于皮肤,起源于表皮干细胞的恶性神经内分泌肿瘤,好发于暴露部位[1],有明显局部复发及早期转移倾向.
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荷负电气溶胶对大鼠烧伤创面表皮干细胞的影响
目的 分析大鼠烧伤创面采用荷负电气溶胶对表皮干细胞的影响并分析作用机制.方法 选取清洁级健康大鼠,在背部侧分别做烧伤创面,随机分为实验组和对照组,实验组采取荷负电气溶胶治疗,对照组大鼠不做任何治疗,分析两组大鼠创面愈合过程,通过免疫组织化学染色法分析干细胞含量,并分析表皮生长因子(EGF)、β1整合素表达变化.结果 烧伤24 h后取创面组织染色观察为深Ⅱ度病理改变,第2天基底层细胞增殖,5 d表皮细胞增殖,排列紧密.对照大鼠第3天局部增殖,第7天增殖明显,分布稀疏.经过治疗,相同时间实验组组织切片内阳性单位含量显著大于对照组(P<0.05).实验组平均愈合时间〔(7.1±1.2)d〕显著短于对照组〔(9.5±1.2)d〕.实验组大鼠在伤后EGF和 β1整合素该表达;在伤后第3天表达明显增高,第7天仍然维持较高表达,对照组大鼠EGF和β1整合素在伤后第3天有所表达,第7天表达高峰,两组大鼠EGF和β1整合素随着治疗时间不同存在显著差异(P<0.05).结论 大鼠烧伤创面实施荷负电气溶胶治疗能够促进表皮干细胞的增殖,其机制可能与EGF、β1整合素表达上升有关.
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毛囊来源的表皮干细胞在不同培养条件下细胞生长情况的比较及效果评价
目的:探讨毛囊来源的表皮干细胞(ESCs)培养条件,阐明成纤维细胞在ESCs培养中的作用.方法:以拔出的毛发为细胞来源,通过细胞培养的方式,比较在无包被、鼠尾胶原包被、Ⅳ型胶原包被和3T3成纤维细胞作为饲养层细胞条件下细胞生长情况.并通过RT-PCR和免疫荧光等方法对培养出的细胞进行细胞角蛋白(CK)15的检测.结果:在无包被、鼠尾胶原包被、Ⅳ型胶原包被和3T3成纤维细胞作为饲养层细胞条件下,以3T3成纤维细胞作为饲养层对细胞的生长为有利;同时,对不同毛囊节段(毛球、中间节段、隆突和峡部)的培养表明,毛囊隆突部位的细胞增殖能力强.RT-PCR及免疫荧光结果表明,应用此种方法从毛囊中分离培养的细胞表达表皮干细胞的特异性标志CKl5.结论:以3T3成纤维细胞作为饲养层细胞,可以从拔出毛发根部的隆突部位培养出ESCs,此培养条件对细胞的生长为有利.
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人表皮干细胞的分离及其生物学特性的评价
目的:分离人表皮干细胞(hKSCs),并评价其生物学特性.方法:取包皮环切术的正常皮肤,采用酶消化、快速贴壁筛选法分离hKSCs,采用倒置相差显微镜及透射电镜观察细胞形态,采用细胞免疫组织化学法和间接免疫荧光法检测细胞的分子标志物,利用流式细胞术检测细胞周期.结果:倒置相差显微镜下显示,细胞为多角形,体积小、核大,呈铺路石样排列,形态一致;透射电镜显示,胞质内细胞器稀少,细胞核大,核内具有丰富的异染色质;免疫细胞化学、间接免疫荧光和流式细胞术结果显示,KSCs相对特异性标志物CK15、CK19、P63和CD29呈阳性表达,成纤维特异性标志物Vimentin和表皮终末分化标志物CK10呈阴性表达,RT-PCR结果与上述结果一致;细胞周期检测结果显示,大多数细胞处于G0/G1期,符合hKSCs的慢周期特性.结论:快速贴壁筛选法可分离出纯度较高的hKSCs,可为后续的实验研究提供细胞来源.
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不同年龄组人表皮干细胞Integrin β1表达分析研究
目的:分析不同年龄组包皮组织中表皮干细胞Integrin β1的表达,为组织工程学种子细胞的选用提供依据.方法:利用Dis-pase Ⅱ和BSA共同作用,分散表皮和真皮组织部分.对不同年龄组分离的表皮干细胞进行Integrinβ1免疫荧光染色,利用流式细胞仪检测不同年龄组Integrin β1表达的阳性率.结果:不同年龄组分离得到的表皮干细胞形态一致.细胞生长状态和生长速度以7岁年龄组为佳,其次是16岁年龄组,后是30岁年龄组.流式细胞仪检测不同年龄组Integrin β1的表达,7岁组阳性率为93％,16岁组阳性率为56％,30岁组阳性率仅为3.5％.结论:随着年龄的增长,皮肤组织中表皮干细胞的含量降低,低年龄段皮肤组织是组织工程学种子细胞的良好选择.
关键词： 表皮干细胞 分离 培养 Integrin β1 流式细胞仪 -
联合应用NGF和胰岛素对糖尿病大鼠烫伤创面表皮干细胞的影响
目的:通过局部联合应用神经生长因子和胰岛素对糖尿病大鼠深Ⅱ度烫伤创面表皮干细胞标记物B1整合素和角蛋白19(K19)表达的影响,探讨神经生长因子和胰岛素联合应用于糖尿病烫伤创面治疗后对创面愈合的影响.方法:雄性wistar大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型60只,1月后在大鼠背部造成深Ⅱ度烫伤.将大鼠随机分为糖尿病对照组(B)、胰岛素治疗组(C)、神经生长因子治疗组(D)、神经生长因子联合胰岛素治疗组(E),每组15只.另取15只正常雄性wistar大鼠作为正常对照组(A).观察伤后3、7、11、15、21d各组创面愈合情况,检测创面β1整合素和角蛋白19(K19)的表达并计算创面愈合率.结果:E组创面愈合率自第7天起较A、B、C、D组增加,为[(25.33± 2.32)％,(P＜0.05)]；A、C、D组创面愈合率较B组增加分别为[(22.51±1.78)％,(16.68± 1.95)％,(18.29± 1.70)％,(P＜0.05)].E组整合素β1和角蛋白19(K19)表达自伤后第7至21天各时相点显著增加,(P＜o.05).结论:糖尿病大鼠深Ⅱ度烫伤创面局部联合应用神经生长因子和胰岛素可促进表皮干细胞的增殖与分化从而加速创面的愈合.
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人皮肤表皮干细胞体外培养与应用研究进展
人皮肤表皮干细胞是具有无限增殖潜能以及多向分化能力的专能干细胞,广泛存在于表皮基底层以及毛囊隆突部位.目前,表皮干细胞在分离、纯化、培养等领域都取得了一定进展.表皮干细胞的应用主要在皮肤创面的修复、组织工程皮肤的构建以及基因治疗等领域.本文从干细胞的来源、分离、纯化鉴定、培养与应用等方面进行综述.
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龟版有效成分抗无血清损伤表皮干细胞凋亡的研究
目的:探讨龟版有效成分对无血清培养所致的表皮干细胞(epidermal stem cell,ESC)凋亡的药效作用和可能机制.方法:分离培养孕龄2周的Sprague-Dawley胎鼠背部皮肤制备ESC,分为正常组、模型对照组和龟版有效成分各组.采用含龟版有效成分的无血清达尔伯克改良伊格尔培养基培养24、48和72 h后,用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5---苯基四氮唑溴盐（3-（4,5-dimethyhhiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法检测ESC的活力,筛选药物佳作用时间；ESC用各药物培养48 h后,异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V和碘化丙锭双标后用流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (caspase-3)和Bcl-2蛋白的表达水平.结果:MTT检测结果表明,在24、48和72 h时各有效成分组ESC活力较模型对照组增强(P＜0.01),且作用48 h时乙酸乙酯部位提取物组ESC活力高于十八酸乙酯、十四酸甾醇酯、4-甾酮各组(P＜0.05,P＜0.01).作用48 h时,乙酸乙酯部位提取物抗凋亡效果强,4-甾酮抗凋亡效果弱.蛋白免疫印迹结果表明,乙酸乙酯部位提取物、十八酸乙酯、十四酸甾醇酯、4-甾酮均能显著上调Bcl-2和下调caspase-3的表达,有抗凋亡作用.结论:乙酸乙酯部位提取物有较强的抗ESC凋亡作用,优于它的各组分单独作用,调控Bcl-2与caspase-3之间的表达平衡可能是其抗ESC凋亡的机制之一.
关键词： 龟版 表皮干细胞 凋亡 Bcl-2 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 -
表皮干细胞的生物学特性、标记及调节
成人组织干细胞是一类具有自我更新能力及多向分化潜能的多能干或专能干细胞,终身存在于骨髓、骨骼肌、胃肠道、肝脏、中枢神经系统等多个脏器组织中.在一定条件下,这些细胞可按照发育途径通过分裂增殖产生分化细胞.其自身复制能力有限,但其子代细胞在形成终末分化细胞之前却具有非凡的繁殖能力.皮肤组织中也存在着特异性干细胞——表皮干细胞(epidermal stem cells,ESC),具极强的增殖潜能和自我更新能力.皮肤表皮干细胞数量极少,仅占表皮基底层细胞的1%～10%,其对于维持皮肤组织新陈代谢、创面修复及肿瘤发生等均有重要意义.
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表皮干细胞抽提物重编程脂肪干细胞表达表皮细胞表型的实验研究
目的 研究富集的表皮干细胞(Keratinocyte enriched with epidermal stem cells,KSC)抽提物对重编程人脂肪干细胞(Adipose derived stem cells,ASCs)表达表皮细胞表型的影响.方法 常规方法收集表皮细胞(Keratinocyte,KC)后,应用Ⅳ型胶原差速贴壁法分别收集KSC与富集后剩余的表皮细胞(Keratinocyte enriched with epidermal stem cells left,KCL),鉴定K19和P63的阳性表达率,Gimsa染色法测定KC 、KSC、KCL的克隆形成率,分别制备KC、KSC、KCL 的细胞抽提物,作用于链球菌溶血素-O(SLO)通透处理过的原代ASCs,分别应用流式细胞仪与Western-blot测定重编程后ASCs中广谱角蛋白(Pan cytokeratin,P-CK)与ASCs的BRG1表达变化.结果 KSC与KC、KCL来源的细胞抽提物重编程ASCs的CK及BRG1表达率,均有明显统计学差异(P＜0.01).结论 脂肪干细胞在表皮细胞抽提物的诱导作用下能表达表皮细胞表型,且对表皮细胞优化处理后的KSC有更加显著的重编程作用.
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诱导表皮干细胞向汗腺上皮细胞分化的研究
目的 通过探索体外诱导表皮干细胞向汗腺上皮分化可能性,为汗腺组织工程探索新的种子细胞来源.方法 分别收集正常皮肤表皮细胞,利用流式细胞仪多参数分选表皮干细胞;于不同时间点连续观察,不同浓度EGF(50-1000 ng/mL)作用于表皮干细胞后的细胞生长动力学变化,免疫荧光鉴定汗腺细胞表型(NHE-1,NKCC-1)流式细胞仪分析不同浓度EGF对于细胞的毒性.结果 50 ng/mL和100 ng/mL EGF对表皮细胞促增殖能力明显,且二者无显著差异(P＞0.05);500 ng/mL和1 000 ng/mL EGF抑制细胞增殖.1 000 ng/mL EGF对细胞增殖的抑制作用更明显(P＜0.05).表皮干细胞经过50 ng/mL EGF诱导后表达汗腺上皮相对特异性标记NHE-1及NKCC-1.结论 表皮干细胞可成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源.50 ng/ml EGF可作为相对优化的表皮干细胞诱导条件.
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表皮干细胞的快速高效分离
目的 寻找一种快递高效分离组织工程化皮肤种子细胞-皮肤干细胞的方法.方法 取成人手术切除之包皮,利用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶消化法,快速分离表皮干细胞,并对其进行鉴定及相关的生物学特性的研究.结果 应用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶,可在3小时内快速分离到表皮干细胞及成纤维细胞,经流式细胞仪及细胞免疫荧光鉴定,表皮细胞群体中角蛋白19(K19)阳性表达的细胞即表皮干细胞约占18%,但是其体外短期扩增仍较困难.结论 利用胶原酶消化法可在短期内高效分离到用于构建组织工程化皮肤的种子细胞,这为快速构建组织工程化皮肤提供了可能.
