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重组戊型肝炎病毒抗原ELISA检测方法的建立
目的 建立重组戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于HE疫苗中HEV抗原含量的检测.方法 以重组HEV病毒样颗粒作为免疫原,免疫母鸡,制备抗HEV-IgY多克隆抗体,纯化后作为包被抗体,HRP标记的抗HEV单克隆抗体作为检测抗体,建立HEV抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,并对其进行验证.用建立的方法检测3批HE疫苗成品的HEV抗原含量,计算HEV抗原对氢氧化铝的吸附率.结果 建立的ELISA方法线性范围为2～128 ng/ml,低定量限为2 ng/ml;该方法检测冻干甲肝减毒活疫苗、重组人白介素-2( IL-2)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、人血白蛋白、小牛血清及健康人血清均无交叉反应；该方法检测3个浓度的HEV抗原内部参考品的回收率在95. 13％～104.50％之间,试验内及试验间变异系数均＜15％；包被抗HEV-IgY的酶标板于37℃放置5d,其检测HEV抗原内部参考品的A 450值及敏感性均未发生显著变化；3批HE疫苗成品中HEV抗原对氢氧化铝的吸附率均大于95％,符合相关质控要求.结论 已成功建立了HEV抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,可用于HEV抗原含量的检测.
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抗咽喉炎常见菌IgY抗体的制备及其特性的研究
目的制备抗β-溶血性链球菌、G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌3种咽喉炎常见菌IgY抗体,并分析其特性.方法采用超声波破碎法将3种咽喉菌制备成可溶性抗原液,免疫产蛋母鸡,从鸡蛋黄中提取IgY抗体,应用免疫电泳、ELISA、SDS-PAGE检测抗3种咽喉菌IgY抗体的特性及热稳定性.结果抗原免疫母鸡10 d后,鸡蛋黄中即有抗3种咽喉菌的IgY抗体产生,60d时抗体滴度高达1:102 400,IgY抗体滴度在室温可保持5～6个月不变.结论制备的抗3种咽喉菌IgY抗体滴度高,特异性强,稳定性好.
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特异性卵黄抗体(IgY)对小鼠大肠杆菌败血症的保护作用
目的:研究特异性IgY对小鼠大肠杆菌败血症的保护作用.方法:以灭活的E.coli O111免疫产蛋母鸡,抗体经水稀释及盐析分离纯化.ELISA法检测大肠杆菌特异性IgY对大肠杆菌及LPS的结合活性.腹腔注射E.coli O111(1011cfu/mL)建立小鼠败血症模型,攻毒剂量为0.1mL/10g体重.小鼠随机分为5组,分别给药保护:空白组(生理盐水)、阴性对照组(非特异性IgY,20mg/mL)、阳性对照组(头孢哌酮20mg/mL)、高剂量组(特异性IgY,40mg/mL),低剂量组(特异性IgY,20mg/mL).给药剂量为:攻毒前,0.15mL/10g体重,每天一次,共两天;攻毒后,0.25mL/10g体重,每天一次,共七天.观察小鼠临床表现、体重变化、白细胞(WBC)和血小板(PLT)数变化及各组小鼠的死亡率.结果:特异性IgY与E.coli O111和LPS均有体外结合活性.大肠杆菌攻毒后,小鼠体重下降,各组小鼠外周血中WBC和PLT数均有不同程度的下降.特异性IgY保护组各项指标较快恢复到正常水平,其他组恢复缓慢.各组小鼠七天内的死亡率分别为:空白组与阴性对照组都为100%;阳性对照组60%;低剂量IgY组30%;高剂量IgY组10%.结论:特异性IgY对小鼠大肠杆菌败血症有保护作用.
关键词： IgY 败血症 E.coliO111 -
基于IgY抗体检测日本血吸虫循环抗原的间接红细胞凝集试验的建立
目的 建立基于IgY的血吸虫循环抗原的间接红细胞凝集试验(indirect hemagglutination test,IHA)并初步探讨IgY在诊断日本血吸虫病中的应用价值.方法 以日本血吸虫卵可溶性虫抗原(soluble egg antigen,SEA)免疫海蓝蛋鸡,获得抗SEA的IgY抗体.取人O型红细胞醛化、鞣化,形成鞣化后红细胞,并分别用磷酸盐、碳酸盐和柠檬酸盐缓冲液稀释抗SEA-IgY抗体,以确定IgY致敏红细胞佳缓冲液.将IgY溶解于佳的缓冲液中致敏鞣化后红细胞,形成IgY红细胞检测液,用此检测液分别检测感染30、20、10条日本血吸虫尾蚴和正常小鼠血清各10份,初步检测不同感染度小鼠血清的循环抗原.结果 pH7.2磷酸盐缓冲液溶解的IgY所得致敏红细胞检测血清佳,效价可达1∶320.用此IgY-IHA法检测中、高感染度血清(感染20条和30条日本血吸虫尾蚴)阳性率为100％,低感染度血清(感染10条日本血吸虫尾蚴)阳性率为70％,对照组10只小鼠血清全为阴性,特异性为100％.结论 建立了IgY-IHA法,此法检测日本血吸虫病循环抗原具有较高的敏感性.
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日本血吸虫可溶性虫卵抗原经两种免疫途径获得的鸡卵黄抗体IgY动态观察
目的 对比两种免疫途径产生抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的特异性IgY抗体水平动态变化. 方法 7只新西兰兔感染日本血吸虫尾蚴(1 500/只)42 d后解剖收集虫卵,制备SEA.将SEA分别经皮下和静脉注射免疫健康海蓝蛋鸡(3只/组),首次和第2次免疫间隔2周,之后每次间隔4周,共免疫5次,50 μg/(只·次).取两组免疫前,以及首次免疫后2～18周生产的鸡蛋,用水稀释法粗提IgY,ELISA检测每2周IgY的动态变化.IgY纯化试剂盒(EGGstract IgY Purifiction System)纯化静脉组首次免疫后8～18周的IgY,紫外吸收法检测抗体浓度,琼脂糖双扩散法和ELISA检测IgY峰值水平的抗体效价,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析比较免疫前后抗体特异性. 结果 静脉组和皮下组分别在首次免疫后8和12周IgY抗体水平达高峰,A492值分别为1.28和0.78,静脉组IgY水平至18周仍维持较高水平,皮下组抗体水平达到峰值后逐渐下降.纯化后IgY浓度约为6.5～9.0 mg/ml,琼脂糖双扩散法和ELISA测得静脉注射组峰值水平抗体效价分别为1 ∶ 16和1 ∶ 51 200.经SDS-PAGE和Western blotting分析,纯化后的IgY在相对分子质量(Mr)25 000和68 000处各有一条清晰条带,且免疫后IgY可与SEA发生特异性反应. 结论 静脉注射法比皮下注射法能获得更高水平的鸡抗日本血吸虫SEA特异性IgY抗体,且纯化后的IgY抗体具有较好的特异性.
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lgY牙膏对口腔变形链球菌的抑制作用
目的:研究含生物活性物IgY牙膏对口腔变形链球菌的抑制作用.方法:将140位受试者随机分成实验组和对照组.每位受试者经过2个月洗脱期后,分别使用实验牙膏和空白对照牙膏.采用Dentocult SM方法分别测出基线值和使用1d、3d、7d、1个月后以及停止使用牙膏后2周的口腔变形链球菌水平.结果:①实验组受试者口腔中变形链球菌水平的下降发生在使用实验牙膏刷牙后第1天,而对照组则发生在刷牙后的第3天.②随着刷牙时间延长,2组受试者口腔中变形链球菌水平逐步下降.③实验组停止使用实验牙膏刷牙后2周,仍有抑制变形链球菌的作用.结论:与对照组相比,实验组牙膏有增强抑制口腔变形链球菌的作用.
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卵黄抗体IgY检测血吸虫病人循环抗原的初步研究
目的 探讨抗可溶性虫卵抗原(SEA)卵黄抗体(IgY)检测血吸虫循环抗原的应用价值.方法 以纯化的鸡IgY作为捕捉抗体,以酶标抗SEA单克隆抗体NP28-5B为检测抗体的双抗体夹心酶联免疫吸附试验法(S-ELISA)检测急、慢性血吸虫病人和健康人血清,并与常规检测抗体的酶联免疫吸附试验法(SEA-ELISA)作比较.结果 S-ELISA测得SEA浓度(y)与吸光度(A450)值(x)呈明显的正相关(y=459.22x-108.14, r=0.948 1).急性血吸虫病人循环抗原的阳性率为100.00%(9/9),慢性血吸虫病人循环抗原的阳性率为84.44%(38/45),健康人的特异性为96.00%(48/50).两种方法对血吸虫病的检出率差异无统计学意义(P>0.05).结论 S-ELISA具有较好的敏感性和特异性,可用于血吸虫病免疫诊断.
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鸡卵黄抗体的纯化及临床应用
卵黄抗体亦称卵黄免疫球蛋白(IgY),由母鸡血清中选择性地转移到卵黄,是卵黄中唯一的免疫球蛋白,为后代提供被动免疫保护.用鸡代替哺乳动物来生产多克隆抗体具有很多优点:鸡蛋易于收集,抗体产量高,提纯方法简单易行,且IgY不与类风湿因子结合,不激活哺乳动物补体因子等特性,使得IgY在制备针对多种抗原的多克隆抗体、免疫检测诊断、人类和动物疾病的预防治疗方面均得到了广泛的应用,在人类的免疫避孕方面也显示了良好的应用前景.
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卵黄抗体技术应用于大规模制备治疗性抗体的研究进展
目前实验室及临床上使用的抗体多数来源于动物血清,不仅产量低成本高,而且在一定程度上有背于动物权益的保护.随着抗体需求量的不断增加,廉价大规模的抗体制备成了新的研究热点.通过免疫禽类(尤其是鸡)将特异性抗体富集于卵黄中来制备具有独特优点的抗体,有望成为能够替代哺乳动物抗体的大规模制备治疗性抗体的有效手段.
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抗肠道病毒71型外壳蛋白1卵黄抗体的制备和鉴定
目的 克隆肠道病毒71型(EV71)BrCr株外壳蛋白1(VP1)基因,构建原核表达载体PET28a/VP1,表达VP1重组蛋白,以VP1免疫产蛋母鸡,获得抗VP1的鸡免疫球蛋白(IgY).方法 培养Vero细胞,利用Vero细胞增殖肠道病毒EV71 BrCr株,提取病毒总RNA,利用RT-PCR扩增出VP1目的基因,目的基因插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切获得目的基因,插入原核表达载体pET-28a,重组子同时BamHⅠ,EcoRⅠ双酶切和测序鉴定,转化入感受态工程菌E.coli BL21(DE3),获得阳性重组工程菌,经IPTG诱导获得表达融合蛋白,试剂盒纯化蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,用VP1蛋白免疫开产母鸡,收集鸡蛋,利用EGG stractTM IgY Purification System试剂盒提取卵黄抗体IgY,间接ELISA测滴度,SDS-PAGE和Western blotting验证其表达量和免疫活性.结果 本实验成功扩增出肠道病毒EV71 BrCr株VP1基因,获得了含重组表达质粒pET28a/VP1的阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1蛋白,VP1经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,利用纯化后VP1蛋白免疫产蛋母鸡,提取的IgY经ELISA 鉴定后其滴度为1:104,SDS-PAGE和Western blotting证实为抗VP1的特异性IgY.结论 成功的从EV71 BrCr株扩增出VP1基因,构建了PET28a/VP1表达载体,获得高效表达融合蛋白,免疫产蛋母鸡后制备高效价抗VP1蛋白的特异性IgY.
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基于IgY的ELISA用于囊尾蚴循环抗原的检测
目的 建立基于IgY的双抗体夹心ELISA用于囊尾蚴病的诊断.方法 制备并纯化抗囊尾蚴循环抗原(CA)卵黄抗体(IgY),建立以抗CA的IgY为捕获抗体,酶标记抗CA的单克隆抗体1A5为检测抗体的双抗体夹心ELISA法,共检测样品450份,并与捕获抗体和检测抗体均为单克隆抗体的ELISA法比较,验证方法的敏感性、特异性与实用性.结果 成功制备并鉴定了特异性IgY抗体,建立了基于Igy的双抗体夹心ELISA检测体系.IgY-ELISA和双单抗-ELISA检测囊尾蚴CA的灵敏度分别为8.3 μg/L和13.9 μg/L.IgY-ELISA检测囊尾蚴病患者血清与脑脊液的CA阳性率分别为100％ (139/139)与89.5％ (17/19),囊尾蚴病猪血清的阳性率100％ (222/222),健康人与健康猪血清的阴性率为100％.结论 建立的基于lgY的双抗体夹心ELISA检测囊尾蚴CA用于囊尾蚴病诊断,具有较高的特异性和敏感性,可用于囊尾蚴病的辅助诊断.
关键词： 囊尾蚴病 IgY 循环抗原 双抗体夹心酶联免疫吸附实验 -
抗尖吻蝮蛇蛇毒金属酶类共同基序IgY抗体的制备与研究
[目的]制备针对尖吻蝮蛇蛇毒金属蛋白酶类共同基序的IgY抗体,并对其中和蛇毒活性的作用进行研究.[方法]通过分析尖吻蝮蛇蛇毒各类金属蛋白酶类共有序列,设计合成与其酶活性密切相关且高度保守的抗原肽PT1和PT2;偶联复合物KLH-PT1、KLH-PT2免疫母鸡获得IgY抗体.采用ELISA和Western blot等方法对IgY效价及与尖吻蝮蛇蛇毒和短尾蝮蛇蛇毒的交叉反应特性进行初步研究;后通过抗小鼠皮下出血实验对IgY中和活性进行评价.[结果]ELISA、Western blot结果表明,抗KLH-PT1、抗尖吻蝮蛇蛇毒IgY均可与尖吻蝮蛇蛇毒、短尾蝮蛇蛇毒发生交叉反应且后者显著强于前者;抗KLH-PT2 IgY在体外与尖吻蝮蛇蛇毒、短尾蝮蛇蛇毒无明显交叉反应,在体内抗出血实验中却表现出很强的中和毒性作用,并且显著优于前两者.[结论]通过设计金属蛋白酶共有序列抗原肽,制备了能与多种血循型蛇毒交叉反应的IgY抗体,这为制备特异、高效、低毒性且广谱的抗出血型蛇毒抗体奠定了基础.
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抗脂蛋白脂酶卵黄抗体IgY的制备
目的:用人脂蛋白脂酶制备鸡卵黄抗体,并研究其应答持久性、稳定性.方法:用纯化的人脂蛋白脂酶免疫生蛋鸡,琼脂糖免疫扩散法测定IgY抗体效价变化.PEG法结合Sephadex-150凝胶过柱提取抗体;ELISA法测抗体对酸、碱、酶的稳定.结果:免疫后大约3～4周抗体效价达到高值,此高效价可持续3个月;抗体含量为8.11mg/ml蛋黄;IgY在70℃以下基本不失活;在pH4～10时活性无明显变化;胃蛋白酶处理90min后IgY活性稳定.结论:用人脂蛋白脂酶免疫鸡可制备高效价的特异抗体IgY,抗体应答时间持久、稳定性好.
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IgY双抗体夹心ELISA法现场诊断血吸虫病的研究
目的 评价IgY的双抗体夹心ELISA法(S-ELISA)现场诊断血吸虫病的价值.方法 用Lowry法检测包被物的含量,将抗SEA的IgY包被酶标反应板,用棋盘滴定法确定适抗体包被量以及血清稀释度,建立S-ELISA .以改良加藤厚涂片法 (Kato-Katz法) 检测结果为金标准,采用S-ELISA方法检测血吸虫病流行区部分人群血清循环抗原,并同时用SEA-IHA检测循环抗体,比较两者的敏感性和特异性.结果 检测疫区人群174例,Kato-Katz法、S-ELISA和SEA-IHA阳性率分别是6.90%、22.41%和15.52%,经χ2 检验,P＜0.01,差异有极显著性意义;S-ELISA与SEA-IHA比较,两种方法的敏感性和特异性之间的差异无显著性意义(P＞0.05).结论 S-ELISA诊断血吸虫病具有较好的敏感性和特异性,可以用于疫区筛查血吸虫病.
关键词： IgY 双抗体夹心ELISA法 诊断 血吸虫病 -
IgY技术及其医药应用:理论基础
卵黄抗体技术(IgY技术)正在成为生物技术领域和医药研究中的新热点,并且越来越得到国内同仁的重视.因为卵黄抗体(IgY)化学性质稳定,产量高、成本低,以及动物种系发生学距离的优势,更适于生产特异性抗体,具有开发功能性食品和新药的潜能.该文述及该技术发展的背景和理论基础,详细综述了禽类的免疫学系统、lgY技术的生物学基础、理化参数和稳定性.
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免疫鸡产生IgY抗体的技术
IgY技术正在成为生物技术领域和医药研究中的新热点,并且越来越得到国内同仁的重视.因为卵黄抗体(IgY)化学性质稳定,产量高、成本低,以及动物种系距离的优势,更适于生产特异性抗体,具有开发功能性食品和新药的潜能.作为系列介绍的第二部分,本文详细介绍和探讨免疫鸡产生IgY抗体技术的主要技术环节和实践应用方面的具体信息,包括动物饲养,对鸡的免疫,抗体特性,IgY提取技术,鸡单克隆抗体的制备等方面.
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特异性抗P . g-IgY龈下冲洗液对中度和重度慢性牙周炎的疗效观察
选择60例中度或重度慢性牙周炎患者，用特异性抗P. g-IgY龈下冲洗液前后，观察牙周临床指标变化，通过BA-NA实验评价患者口腔各部位牙周致病菌含量的变化。用药后附着丧失、松动度、探诊出血百分比、菌斑占有率、深牙周袋比例均减小且以抗P. g-IgY龈下冲洗液组改善效果为显著。 BANA实验结果表明该龈下冲洗液可显著减少牙周袋和唾液中的牙周致病菌。特异性抗P. g-IgY龈下冲洗液临床疗效好，可作为中度或重度慢性牙周炎的辅助治疗手段，有较高的临床推广价值。
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鸡卵黄抗体(IgY)的性质、提纯及应用于寄生虫学的研究
免疫学IgY技术是近几年发展起来的一种新的生物技术领域及医药研究中的热点技术.本文简要综述鸡卵黄抗体(IgY)的特性、提纯及应用于寄生虫病免疫诊断及免疫治疗等方面,以开拓寄生虫病防治.
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抗白念珠菌IgY对白念珠菌性阴道炎小鼠的保护作用
目的研究抗白念珠菌IgY对阴道感染白念珠菌小鼠的保护作用.方法用环磷酰胺造成BALb/C小鼠免疫功能低下,经阴道感染白念珠菌,用IgY治疗,2天后取阴道冲洗液进行细菌学培养,计算菌落数(CFU).结果感染标准菌株实验组菌落数的几何均数为0.5853,对照组为2.1100;感染临-1菌株实验组菌落数的几何均数为0.5227,对照组为1.9131;两两比较有非常显著性差异(P<0.01).结论抗白念珠菌IgY对免疫功能低下鼠阴道感染白念珠菌有明显的保护作用.
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抗大肠杆菌IgY对大鼠全腹照射后肠源性感染的预防作用
目的建立大鼠全腹照射模型,观察抗大肠杆菌IgY管饲对大鼠肠粘膜结构的变化和细菌移位的影响及对肠源性感染的预防作用,为临床上预防放射性肠粘膜损害以及肠源性感染提供实验依据.方法健康SD大鼠30只,体重(200±20)g,雌雄各半.大鼠随机分为3组(每组10只):正常对照组(A组)、照射对照组(B组)、IgY预防组(C组).用直线加速器对大鼠进行全腹照射,总照射剂量为1 000 cGy.自照射前一天开始进行IgY管饲.A、B两组大鼠不灌任何药物,C组大鼠以10%抗大肠杆菌IgY水溶液1.5 ml管饲,q12 h.持续4 d.照射后第4天处死大鼠,无菌条件下打开腹腔,取肝、脾及肠系膜淋巴结制成匀浆,行细菌培养,统计细菌移位率;从心腔采血,分离血清,测定内毒素水平.结果B组细菌移位明显,肝、脾、淋巴结组织细菌培养总阳性率达96.7%,血清内毒素水平明显升高;C组肝、脾、淋巴结组织细菌培养总阳性率为6.7%,血清内毒素水平下降,且与A组相比均有显著性差异(P＜0.05～0.001).结论抗大肠杆菌IgY能明显降低全腹照射后肝、脾、肠系膜淋巴结的细菌培养阳性率,提示具有保护大鼠肠粘膜屏障,减少细菌移位的作用;并且能改善反映大鼠肠源性感染的指标,降低血中内毒素,提示对肠源性感染具有预防作用.
