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深圳市首例本地登革热3型病例的病原学检测与分析
目的对2016年深圳市报告的首例本地疑似登革热病例查明病因.分离鉴定病原体,从分子水平分析分离株的生物学特征.方法对疑似患者血清标本采用ELISA、胶体金免疫层析法和荧光RT-PCR方法分别检测登革病毒抗体、NS1抗原和病毒核酸,并用C6/36细胞分离登革病毒.采用RT-PCR方法扩增病毒PrM/M-E基因后进行序列测定,并与不同国家和地区的登革毒株进行同源性比较和进化树分析.结果从患者血清标本中检测到登革病毒IgM抗体、NS1抗原和登革3型病毒核酸,并成功分离到登革3型病毒,将其命名为DENV3-SZ1648.深圳市登革3型病毒分离株SZ1648与登革3型国际标准株H87株、国内外流行株80-2、GWL-25株在PrM/M-E基因上核苷酸同源性分别为92.0％、91.8％和90.3％,而与登革1、2、4型国际标准株HAWAII、NGC、H241同源性分别为68.7％、64.2％和63.2％.进化树显示SZ1648株与2007年印度尼西亚分离株MKS-0098亲缘关系近,在进化树的同一分支上,和85-159株(Indonedia 1985)、2167株(Tahiti 1989)、29472株(Fiji1992)等同属基因Ⅰ亚型.患者发病前1个月在深圳居住,无输血史、无外出史.结论从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该本地病例是由登革3型病毒引起,这也是深圳市首次报道存在本地登革3型病毒的疫情,该毒株有可能来源于印度尼西亚.
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中国广西登革3型病毒分离株基因组序列特征分析
目的 对我国广西登革3型病毒分离株桂登-1株(GD-1株)和桂登-11株(GD-11株)进行全基因组序列测定和分析,为了解其地理来源提供依据. 方法 根据GenBank提交的登革3型病毒基因序列设计9对引物,RT-PCR方法分段扩增GD-1和GD-11株基因序列,测序后进行拼接,得到其全基因组序列. 结果 两株病毒全长均为10 707 nt,与国际参考株H87株核苷酸同源性为96.0％,氨基酸同源性为98.8％.GD-1株和GD-11株间仅有4个氨基酸差异,二者与H87株分别存在39和41个氨基酸差异.对3'UTR二级结构进行预测,二者与H87株存在较大差异.根据E蛋白基因序列对两株病毒进行进化分析,GD-1和GD-11均属于亚型Ⅱ,与分离自泰国的两毒株进化关系较近. 结论 GD-1和GD-11均属于登革3型病毒亚型Ⅱ,二者可能是源自泰国的病原.
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登革3型病毒NS1基因重组质粒DNA的构建及其免疫原性观察
目的:构建登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒,观察其免疫原性,为登革新型疫苗的研究提供依据.方法:从感染鼠脑中提取登革3型病毒RNA,经RT-PCR获得NS1基因片段,然后将其克隆到真核表达载体中.用电穿孔法将重组质粒DNA转入COS7细胞,通过免疫荧光法检测外源基因在真核细胞中的表达.将重组质粒DNA免疫BALB/c小鼠,观察其免疫原性.结果:通过酶切鉴定和序列测定证实了NS1基因片段已经插入真核表达载体.用免疫荧光法证明转染了重组质粒的COS7细胞的胞浆中有特异荧光.重组质粒DNA免疫小鼠后可观察到诱发产生的细胞免疫应答.结论:含有登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒可以在COS7细胞中进行表达,而且能够诱导小鼠产生细胞免疫应答.
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深圳市一起输入性登革热疫情的分子流行病学研究
目的 对2007年深圳市报告的一起输入性疑似登革热病例查明病因.分离鉴定病原体,从分子水平分析分离株的生物学特征.方法 对疑似患者血清标本采用ELISA、胶体金免疫层析法和实时荧光定量PCR方法分别检测登革病毒IgM、IgG抗体和病毒核酸,并用C6/36细胞分离登革病毒.采用RT-PCR方法扩增病毒PrM/M-E基因后进行序列测定,并与不同国家和地区的登革毒株进行同源性比较和进化树分析.结果 从患者血清标本中检测到登革病毒IgM、IgG抗体和登革3型病毒核酸,并首次成功分离到登革3病毒,将其命名为DEN3-SZ0739.深圳市登革3型病毒分离株SZ0739与登革3型国际标准株H87株、国内外流行株80-2、GWL-25株在PrM/M-E基因上核苷酸同源性分别为94.1%、93.9%、96.9%,而与登革1、2、4型国际标准株HAWAII、NGC、H241同源性分别为66.1%、59.1%、58.2%.进化树显示SZ0739株与2007年新加坡分离株SGEHI(D3)0235Y07亲缘关系近,在进化树的同一分支上,和1 416株(India 1984)、1 326株(Sri Lanka 1981)、1 696株(Samoa 1986)等同属基因Ⅲ亚型.结论 从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该输入病例是由登革3型病毒引起,该毒株有可能来源于新加坡.
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登革3型病毒义乌流行株免疫原性研究
目的 对2009年浙江省义鸟市暴发流行的登革3型病毒进行系统进化分析并初步研究其E蛋白的免疫原性.方法 RT-PCR扩增义乌分离株全基因组,利用MEGA 4分别构建E及NS1区域核苷酸及氨基酸系统发生树,进行系统进化分析.构建重组质粒JESS -ywD3 prM/E397JEV-pcDNA5,IFA及Western Blot检测E蛋白在293T细胞中的表达及分泌情况.将纯化后的分泌性E蛋白免疫8ALB/c小鼠,通过ELISA、中和试验等方法对体液免疫进行测定.结果 登革3型病毒义乌分离株与广州GZID3株及印度GWIL-25株核苷酸及氨基欧序列同源性均达到99%以上；其分泌性E蛋白可以刺激小鼠产生登革特异性IgG抗体及针对同型病毒的中和抗体.结论 义乌分离株属于登革3型病毒亚型Ⅲ,其分泌性E蛋白具有一定的免疫原性.
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登革3型病毒义乌流行株免疫原性研究
目的 对2009年浙江省义乌市暴发流行的登革3型病毒进行系统进化分析并初步研究其E蛋白的免疫原性.方法 RT-PCR扩增义乌分离株全基因组,利用MEGA 4分别构建E及NSl区域核苷酸及氨基酸系统发生树,进行系统进化分析.构建重组质粒JESS-ywD3prM/E397JEV-pcDNA5,IFA及Western Blot检测E蛋白在293T细胞中的表达及分泌情况.将纯化后的分泌性E蛋白免疫BALB/c小鼠,通过ELISA、中和试验等方法对体液免疫进行测定.结果 登革3型病毒义乌分离株与广州GZlD3株及印度GWL-25株核苷酸及氨基酸序列同源性均达到99%以上;其分泌性E蛋白可以刺激小鼠产生登革特异性IgG抗体及针对同型病毒的中和抗体.结论 义乌分离株属于登革3型病毒亚型Ⅲ,其分泌性E蛋白具有一定的免疫原性.
