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ShRNA靶向干扰BHRF1基因抑制鼻咽癌细胞增殖的实验研究
目的：观察BHRF1 shRNA质粒载体转染对人鼻咽癌CNE2细胞中的BHRF1基因沉默及细胞增殖和凋亡的影响，以及肿瘤细胞对放射敏感性的变化。方法利用RNAi技术将负载BHRF1 shRNA的质粒载体转染至人鼻咽癌CNE2细胞，一组为BHRF1 shRNA质粒载体转染过的CNE2细胞（观察组），未进行转染的CNE2细胞确定为对照组，经RT-PCR扩增人鼻咽癌组织中BHRF1 cDNA 片段， RT-PCR和Western blot检测BHRF1基因的蛋白水平的表达。并且利用顺铂进行实验，观察使用顺铂后，BHRF1 shRNA转染后的肿瘤细胞是否对放射敏感性有变化。结果 BHRF1 shRNA转染鼻咽癌CNE2细胞后，细胞内BHRF1 mRNA表达量（2.02±0.53），对照转染前明显下调，明显下调，与对照组的（29.82±0.64）比较，差异有显著性意义（P<0.01）；DDP和8G放疗作用24 h以后，被转染的细胞的中的蛋白表达大大降低（P<0.05），癌细胞凋亡率上升，明显比对照组癌细胞的凋亡率高（P<0.05）。结论利用RNA干扰技术对人鼻咽癌治疗具有潜在应用价值，BHRF1 shRNA质粒载体不仅仅能调控细胞基因的表达，而且还能够提高癌细胞对顺铂的敏感性。
关键词： BHRF1 shRNA CNE2细胞 BHRF1 顺铂 RT-PCR -
EBVaGC中LMP1和BHRF1的表达与血管生成淋巴管生成的关联性研究
目的 探讨EB病毒相关性胃癌中LMP1和BHRF1的表达与血管生成、淋巴管生成的关系.方法 选取EB病毒相关性胃癌组织标本采用免疫组化方法检测LMP1、BHRF1、VEGF-C、LYVE-1和CD34的表达水平,分析其可能存在的关系.结果 30例EBVaGC组织中不同TNM分期、有无周围淋巴结转移的LMP1蛋白的表达阳性率差异无统计学意义(P＞0.05)；BHRF1表达和TNM分期、有无周围淋巴结转移有关联(P＜0.05).VEGF-C表达与周围淋巴结转移有关联(P＜0.05)；EBVaGC中MVD在不同TNM分期之间有统计学意义(P＜0.05)；MLVD与在不同TNM分期和有无周围淋巴结转移之间有统计学意义(P＜0.05).BHRF1的表达与MVD无统计学关联,而与MLVD有统计学关联(P＜0.05).VEGF-C阳性表达的19例EBVaGC组织中,MVD和MLVD均明显高于阴性组,两组比较其差异具有显著的统计学意义(P＜0.05).结论 EB病毒相关性胃癌中LMP1的表达率低,BHRF1的表达率高,可能与EB病毒相关性胃癌较少发生淋巴结转移有关.VEGF-C高表达说明VEGF-C可能参与EBVaGC的血管和淋巴管生成,其高表达间接促进肿瘤细胞沿新生的淋巴管迁徙和转移.
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BHRF1基因对丝裂霉素诱导胃癌细胞SGC7901凋亡影响
目的 探讨EB病毒早期基因BHRF1的表达对丝裂霉素诱发胃癌细胞SGC7901凋亡的影响.方法 构建pcDNA3.1-BHRF1表达载体,应用脂质体转染法将BHRF1表达载体转染胃癌细胞系SGC7901,MTT法检测细胞生长情况.实验分为细胞对照组、空载体对照组和目的 基因转染组,细胞对照组仅接种SGC7901细胞,空载体对照组将pcDNA3.1空载体转染入SGC7901细胞中,目的 基因转染组将重组质粒pcDNA3.1-BHRF1转染人SGC7901细胞中.分别培养24、48和72 h后,用浓度为30 mg/L的丝裂霉素处理,流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst33258荧光染色方法检测凋亡小体.结果 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒构建成功.MTT实验显示目的 基因转染能明显拮抗由于丝裂霉素作用导致的细胞生长抑制;BHRF1转染+丝裂霉素处理组凋亡小体明显少于对照组,细胞凋亡率明显低于对照组,差异均有统计学意义(F=6 250.510,q=56.992、51.613,P＜0.01).结论 BHRF1基因具有明显拮抗丝裂霉素诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的作用.
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EB病毒BHRF1基因慢病毒载体的构建及功能鉴定
目的:构建并制备能够有效表达EB病毒BHRF1基因的重组慢病毒载体,观察BHRF1表达对人胚肺成纤维细胞(KMB17)凋亡的影响.方法:采用RT-PCR法,从B95-8细胞扩增EBV BHRF1基因,克隆至pWPI GW慢病毒载体上,与pVSVG及pSPAX质粒共转染人胚肾293T细胞,包装出重组慢病毒.将纯化后的重组慢病毒直接感染293T和KMB17细胞,荧光显微镜、实时定量RT-PCR、免疫印迹等方法检测BHRF1在细胞中的表达水平.流式细胞仪检测BHRF1表达对凋亡诱导剂或无血清培养诱发KMB17细胞凋亡的影响.结果:重组慢病毒介导BHRF1在293T和KMB17细胞内获得表达,能有效地抑制KMB17细胞的凋亡.结论:成功构建了表达BHRF1基因的重组慢病毒载体.
