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试用ICAM-1相关小分子肽抑制角朊细胞介导的共刺激效应
目的:探讨ICAM-1相关肽抑制角朊细胞将超抗原TSST-1递呈给T淋巴细胞.方法:应用鼠抗人CD54单克隆抗体筛选噬菌体随机十五肽库,经4轮筛选后,挑取20个克隆进行测序,利用含保守序列的阳性克隆噬菌体对角朊细胞递呈超抗原TSST-1给T细胞进行阻断试验.结果:得到保守序列为ITRSFQSSMEPGPPG,所筛选的阳性噬菌体克隆与野生型噬菌体相比具有明显的阻断效应(P＜0.01).结论:ICAM-1相关小分子肽可望降低超抗原介导的皮肤炎症反应.
关键词： 噬菌体展示技术 细胞间粘附分子-1 超抗原 中毒性休克综合征毒素-1 角朊细胞 -
肠毒素C2第20和22位氨基酸对其超抗原活性的影响
目的：揭示突变蛋白SEC2（T20L／G22E）超抗原活性较野生型SEC2显著增强的潜在机制。方法：WST-1法检测突变蛋白SEC2（T20L／G22E）在体外刺激小鼠脾淋巴细胞增殖活性，进一步应用流式细胞术和荧光定量PCR技术分别检测CD4＋和CD8＋T淋巴细胞增殖、特异性VβT淋巴细胞增殖以及相关细胞因子mRNA丰度变化。结果：与野生型SEC2相比，突变蛋白SEC2（T20L／G22E）能够在体外显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，但二者具有相似的特异性VβT淋巴细胞增殖谱，并且SEC2（ T20L／G22E）能够较rSEC2激活更多携带有Vβ5.3、Vβ8.1及Vβ8.3的T 淋巴细胞；进一步体内实验发现 SEC2（T20L／G22E）能够较rSEC2激活更多外周血和脾脏中CD4＋和CD8＋T淋巴细胞增殖及相关细胞因子的表达。结论：突变蛋白SEC2（T20L／G22E）超抗原活性增强的机制可能是用亮氨酸和谷氨酸替代原来20和22位上的氨基酸后提高了SEC2（T20L／G22 E）与特异性TCR-Vβ的亲和力，进一步激活更多的SEC2特异性T淋巴细胞，终引起T淋巴细胞亚型的显著性增殖，同时诱导更多与抗肿瘤、增殖相关的细胞因子的表达。
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素C2 超抗原 T淋巴细胞 细胞因子 -
SEC对胶质瘤的体内杀伤及其联合放射治疗的研究
目的:观察SEC活化的淋巴细胞对胶质瘤的体内杀伤作用,并观察SEC联合手术、放疗、化疗对胶质瘤的治疗效果.方法:选用T、B淋巴细胞联合免疫缺陷的SCID小鼠,通过建立荷瘤动物模型及HuPBL-SCID免疫嵌合模型,观察肿瘤生长曲线,荷瘤小鼠生存曲线.30例胶质瘤患者,均经手术切除、放疗、化疗,随机分对照组,处理1组(全身应用SEC),处理2组(局部应用经SEC活化的淋巴细胞).结合MRI片观察疗效.结果:生长曲线显示:A组、C组、B组对胶质瘤的抑制率分别为58.5%、46.2%和36.3%.生存期曲线显示:对照组(D组)小鼠于第27天开始出现死亡,至第40天全部死亡,而A组小鼠在40天才开始出现死亡,其中有50%的小鼠到观察的后时期(60天)仍生存良好.临床资料显示对照组有效率为40%,处理1组及处理2组有效率为50%和62.5%.结论:SEC在胶质瘤移植后的人源化免疫嵌合模型(SCID/HuPBL/SHG44)中显示出强大的抗胶质瘤作用.SEC与手术、放疗、化疗结合,能明显提高临床病人的疗效.
关键词： 超抗原 胶质瘤 重症联合免疫缺陷型小鼠 综合治疗 -
肝癌靶向性超抗原基因疫苗的设计和预测
目的:探讨AFP顺式作用元件调控的肝癌特异性减毒超抗原疫苗(SEA(D227A)-Linker-CD80tm)设计的合理性.方法:应用核酸和蛋白质分析软件Gene Construction Kit2.0、ANTHERPRO5.0、JAMBW1.1和www.expasy.com网站提供的方案,分析重组体的开放读框以及融合蛋白的可及性、柔性、抗原性和疏水性,并作了跨膜区和二级结构模拟.结果:重组体的转录受AFP顺式作用元件调控,Linker所在部位柔性高,可及性弱,不改变两侧蛋白分子的抗原性和疏水性.融合蛋白表达后,被CD80tm锚定于肝癌细胞表面,超抗原部分(SEA)表达在细胞膜外,二级结构预测Linker不改变蛋白结构,完全符合作者设计疫苗的初衷.结论:重组疫苗设计合理,特异性高,融合蛋白有很大可能保留了SEA和CD80tm的理化特性,为进一步的实践操作提供了可靠的理论基础.
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葡萄球菌肠毒素超抗原广谱抑制性多肽的设计及空间结构研究
目的：以SEs氨基酸高度保守序列作靶序列设计抑制性多肽，研究筛选出的多肽P72的空间结构。方法：用生物信息学软件“Vector NTI 10.3，InsightII 2000，Discovery Studio 1.7”等分析及预测多肽P72的空间结构。结果：P72在SEA、SEB和SEC的同源序列在空间结构具有高度的相似性，P72远离SEB的TCR和MHCⅡ结合位。结论：P72可能不是与MHCⅡ类分子及TCR结合而产生的抑制作用，其具体的抑制机制有待深入研究。
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超抗原SEB体外诱导胸腺细胞凋亡的研究
目的:观察超抗原SEB能否APC的辅助下体外诱导胸腺细胞凋亡,并研究其机制.方法:SEB作用于与APC混合培养的胸腺细胞,用DNA凝胶电泳、DNA片段测定等判定胸腺细胞凋亡并作定量分析;用间接免疫荧光法标记并以流式细胞仪检测Fas、FasL的表达.结果:SEB处理组胸腺细胞有凋亡表现且凋亡率明显高于对照组,Fas、FasL的表达明显高于对照组.结论:SEB可以于体外在APC辅助下诱导胸腺细胞凋亡,Fas、FasL的高表达可能在凋亡中起重要作用,这可能为体外研究胸腺细胞阴性选择过程提供一种方法.
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金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆、表达、纯化与鉴定
目的构建含SEA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达.方法应用PCR扩增SEA基因片段,与克隆载体pGEM T-easy连接,插入到表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达及鉴定.结果PCR扩增约770 bp的基因片段,克隆至载体后,经测序与文献报道结果一致,表达蛋白相对分子质量约31 000,纯化后鉴定为SEA蛋白.结论已成功获得SEA蛋白,为其进一步研究和应用奠定基础.
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Survivin启动子调控sea基因真核表达质粒的构建及其在肺癌细胞中的特异性表达
目的 构建Survivin启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达.方法 以金黄葡萄球菌(ATCC25923)基因组为模板,PCR扩增sea基因.用sea基因替代以Survivin启动子为调控序列的pGL-S-RED质粒中的Red基因,构建真核表达质粒pGL-S-SEA.酶切及测序鉴定后,用脂质体转染A549细胞和MRC-5人胚肺成纤维细胞.RT-PCR检测两种细胞sea基因的转录情况.结果 Survivin启动子调控的、以超抗原SEA编码序列CDS为目的基因的真核表达质粒pGL-S-SEA构建正确,并在A549细胞中启动了sea基因的转录,其强度为内参基因(GAPDH)的65.96%,而在MRC-5细胞对照中未检测到sea基因的转录.结论 已成功构建Survivin启动子调控的sea基因真核表达质粒,survivin启动子可在转录水平特异性地调控sea基因在A549细胞内表达,为下一步以其作为基因疫苗治疗肺癌奠定了基础.
关键词： Survivin启动子 超抗原 葡萄球菌肠毒素A 肺癌 基因疗法 -
钙调神经磷酸酶对金黄色葡萄球菌肠毒素C2超抗原活性的作用
目的 探讨钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)对金黄色葡萄球菌肠毒素C2(staphylococcal enterotoxin C2,SEC2)发挥超抗原活性的作用.方法 以终浓度为0.5、1、2、3和4μg/ml的重组野生型rSEC2及其增强型突变体蛋白mSEC2(T20L/G22E/H118A/H122A)刺激SD大鼠脾淋巴细胞,MTT法检测大鼠脾淋巴细胞增殖水平;检测终浓度为1 μg/ml的rSEC2和mSEC2在诱导大鼠脾淋巴细胞增殖过程中CaN活性的变化、终浓度为0.1、0.5、1、2和3μg/ml的CaN特异性抑制剂环孢菌素A(cyclosporine A,CsA)对该过程的影响,以及CaN3个亚基CaN Aα、CaN Aβ、CaN B在mRNA水平上的变化.结果 在低浓度rSEC2和mSEC2刺激下,大鼠脾淋巴细胞增殖指数(proliferation index,PI)与给药浓度成正比,高浓度刺激下,可明显抑制大鼠脾淋巴细胞的增殖,1μg/ml浓度增殖效果好;CsA对大鼠脾淋巴细胞增殖具有较强的抑制作用,呈明显的剂量依赖性,当CsA浓度为0.5～1 μg/ml时,rSEC2和mSEC2的刺激作用即被完全抑制;CaN的活性及其相关亚基(CaN Aβ和CaN B)mRNA水平与其超抗原的刺激增殖活性具有明显相关性.结论 CaN对SEC2发挥超抗原活性具有重要作用,为提高SEC2的临床应用价值及规避毒副作用奠定了理论基础.
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金黄葡萄球菌肠毒素C2对小鼠移植瘤的抑制作用
目的 采用小鼠移植瘤模型,对金黄葡萄球菌肠毒素C2的抗肿瘤作用进行研究,以进一步揭示超抗原在肿瘤治疗方面的意义.方法 从金葡菌发酵液中提纯SEC2蛋白,并经SDS-PAGE及测序分析；构建小鼠S180肉瘤和Lewis肺癌移植瘤模型,分别腹腔注射高、中、低剂量(800、400、200 ng/kg)的SEC2,连续给药10 d,同时以环磷酰胺为阳性对照,生理盐水为阴性对照.于给药后第11天处死小鼠,将肿瘤组织分离并称重,比较SEC2对S180肉瘤及Lewis肺癌移植瘤的抑瘤效果.结果 在相对分子质量约30 000处可见目的条带,与理论值相符,N-未端氨基酸测序与文献报道一致；SEC2对两种移植瘤均产生较明显抑制作用,高、中、低剂量SEC2对S180肉瘤的抑瘤率分别达到50.60％、31.81％和19.38％,对Lewis肺癌的抑瘤率分别达到55.62％、45.70％和37.78％.结论 从动物水平上确认了SEC2的抑瘤效果,为进一步开展超抗原抗肿瘤研究奠定了基础.
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TCR β链CDR3谱序与疾病研究概况及进展
近年来,T细胞受体(TCR)互补决定区(CDR)和机体的生理、病理关系研究取得了较大的进展,尤其是在超抗原作用的感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病状态下,TCR β链CDR3谱型能很好地反映T细胞的功能,通过TCR β链CDR3谱型来研究克隆性和寡克隆性增生T细胞,可了解T细胞免疫与疾病发生发展的关系,指导疾病的诊断及免疫治疗,同时可了解正常情况下T细胞的发生和发展情况.
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093 超抗原的免疫功能及其作用机制研究现状
超抗原是一类特殊的蛋白质,具有强大而广泛的免疫活性,尤其是免疫激活作用为人瞩目.超抗原与多种疾病关系密切.近年来有关其结构、免疫功能及其作用机制的研究进展较大.本文对此作一综述.
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超抗原及靶向治疗肿瘤作用进展
超抗原作为一种强大的T细胞激活荆,单用极低浓度便可激活大量的T淋巴细胞克隆来杀伤肿瘤细胞,但这种杀伤作用缺乏特异性.靶向治疗是现阶段肿瘤治疗的新技术,可针对各种机制来抑制肿瘤的发生和发展或消除肿瘤.时此,通过单抗导向或将超抗原结合于肿瘤细胞表面以及基因工程等手段,国内外的学者已在超抗原的靶向抗肿瘤治疗方面开展了大量工作,为肿瘤的防治提供了参考依据.
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金黄色葡萄球菌肠毒素研究进展
金黄色葡萄球菌肠毒素是由金黄色葡萄球菌分泌的一类胞外毒素,其中传统型为SEA-SEE,具有催吐活性.目前也发现了一些催吐活性未知的新类型肠毒素,命名为SEls.所有肠毒素的分子量都在22-28KDa之间,由单一肽链组成,其稳定性好,可耐大多数蛋白水解酶.金黄色葡萄球菌肠毒素具有较强的超抗原特性,可促使T淋巴细胞大量增殖,同时表现出对组织相容性复合物Ⅱ类分子(MHC Ⅱ)等位基因的不同偏爱性.超抗原的产生和调控依赖agr系统,同时也受其它因素的调控,如一些氨基酸.因此在免疫治疗中具有着重要作用.本文从性质、组成、结构、功能、检测方法等方面对金黄色葡萄球菌肠毒素进行简要介绍,为肠毒素的研究提供依据.
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超抗原SEA对小鼠脾淋巴细胞活化和增殖的影响
目的 观察超抗原SEA体外对小鼠脾淋巴细胞活化和增殖的影响.方法 SEA体外诱导小鼠脾淋巴细胞,测定淋巴细胞、T细胞、B细胞的增殖能力,用流式细胞术检测淋巴细胞膜表型的变化,并测定脾淋巴细胞培养上清中IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ的水平.结果 不同浓度SEA诱导脾淋巴细胞的增殖能力不同,在1～4 d内的增殖变化也不完全一样,SEA浓度为103ng/mL时,脾淋巴细胞的活化和增殖能力强.SEA对T细胞(无APC)和B细胞的增殖无明显影响.细胞培养上清中IL-2和INF-γ的水平显著升高,IL-4和IL-10含量低.结论 在APC递呈作用下,SEA能显著诱导初始CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化和增殖,促使THO细胞向TH1细胞分化,分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子.
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超抗原SEA 对 CD4+T细胞TCR Vβ链的取用格局
用超抗原葡萄球菌肠毒素A(SEA)在体内或体外刺激C57BL/6小鼠2种不同的TCR Vβ链T细胞亚群(Vβ3+CD4+、Vβ11+CD4+T细胞),观察二者对超抗原的免疫应答.结果显示:体内初次刺激后,2种T细胞亚群在刺激后第2天都发生增殖,随后均逐渐下降至对照水平.但第2次用同样剂量刺激后,Vβ3+CD4+T细胞群对SEA的再次刺激表现出增殖,而Vβ11+CD4+T细胞群对SEA再次刺激则表现出免疫无能.体外初次、再次刺激也分别获得与体内实验相同的结果.表明超抗原SEA可选择性地取用Vβ3+CD4+T细胞群并对其发生增殖,即超抗原SEA对CD4+T细胞TCR Vβ链的取用格局各有不同.
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超抗原SEA和SEB对正常人TCRVβ基因的限制性取用
金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)作为一种超抗原,以MHC非限制性及TCR Vβ特异性的方式激活T细胞.本文用定量PCR方法,分析SEA和SEB刺激的正常人外周血淋巴细胞T细胞抗原受体Vβ的取用格局.揭示在不同HLA遗传背景下,SEA刺激的淋巴细胞均选择性地取用Vβ3和Vβ6两种基因片段,而SEB刺激的淋巴细胞则优势表达Vβ2、Vβ8和Vβ9.通过比较分析,Sigma产的SEB刺激淋巴细胞后则优势表达Vβ3、Vβ4、Vβ16和Vβ20,提示外周血淋巴细胞在超抗原作用下发生寡克隆扩增.
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献血员CD8+T细胞的增加对CD4+T细胞的抑制作用
实验发现65%体检合格的献血员外周血CD8+T细胞数量明显增加,并伴随CD16+淋巴细胞数量的增加.这些异常的淋巴细胞与葡萄球菌肠毒素B(SEB)共同培养6d,CD4+T细胞无增殖反应.预先用抗CD8抗体去除CD8+T细胞(去除率>90%)再用SEB刺激淋巴细胞,其应答能力恢复正常.增殖的细胞是CD4+T细胞,它们由34.04%增加到99.34%.CD8+T细胞由初的9.57%降低到0.12%.这些结果显示过量的CD8+T细胞有可能是被外原性抗原活化的T细胞.它们直接抑制CD4+T细胞对SEB的免疫应答反应,但不破坏CD4+T细胞的TCRVβ结构.
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uPA阳性口腔颌面部恶性肿瘤T细胞亚群变化
本文用RT-PCR方法测定了口腔颌面部恶性肿瘤患者组织中尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)和纤溶酶原抑制剂1、2型(PAI-1、PAI-2)基因的表达;用MTT和流式细胞术对恶性肿瘤患者免疫细胞的应答反应进行了研究.结果显示,在恶性肿瘤组织中uPA、PAI-1、PAI-2的基因表达分别为100%、66%和22%.而在良性肿瘤和正常组织中PAI-1和PAI-2的表达为0%.表明PAI-1、PAI-2基因的表达与组织中肿瘤的恶性变化有关.实验发现恶性颌面部肿瘤患者外周血CD4+T细胞数量明显增加,达到50.1%,但经超抗原SEB刺激以后这一比例却由初的41%降低到17.1%.本文进一步讨论了上述变化的意义和可能的机制.
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红细胞天然免疫粘附功能对判断重症严重急性呼吸综合征预后的价值
严重急性呼吸综合征(SARS)患者以高热、全身中毒症状起病,发病后血液循环中的淋巴细胞绝对数量急剧下降,血清免疫球蛋白含量进行性降低[1].因此,推测SARS是由病毒超抗原引起的急性免疫损伤性疾病.机体对SARS病毒产物及机体反应性产物的清除能力,与SARS的严重程度及预后密切相关,红细胞广泛表达的补体一型受体(CR1),具有重要的免疫粘附功能[2,3],能粘附、辅助清除循环中的抗原抗体复合物等物质,但是否与SARS的严重程度及预后相关,目前国内、外尚无相关报道.因此,我们对确诊的31例重症SARS患者红细胞天然粘附免疫功能(EIIAF)进行动态观察,并与其对治疗的反应及预后进行分析.
