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多重PCR-SSP方法在RHD基因检测中的应用
目的 应用分子生物学诊断方法分析RhD阴性献血者的RHD基因.方法 首先采用多重PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)方法扩增377名RhD阴性无偿献血者的RHD基因特异性内含子4和外显子7,对扩增结果为阴性的标本则继续采用PCR-SSP检测RHD基因启动子和外显子10.结果 337名RhD阴性无偿献血者中,24.92％(84/337)为RHD基因内含子4和外显子7阳性,余253例内含子4和外显子7阴性标本中的8.69％ (22/253)为启动子和外显子10阳性;本组RhD阴性无偿献血者的RHD基因阳性率为31.45％(106/337).结论 多重PCR-SSP方法检测RHD基因简单易行,可用于对血清学RhD阴性者的RHD基因确认.
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高通量MLPA基因分型技术在1个Del表型家系基因鉴定中的应用
目的 对1个Del表型家系作基因鉴定.方法 运用血型血清学方法对先证者及其家系的3名成员作RhD及相关血型抗原鉴定;提取先证者及其父母和妹妹的静脉血DNA.运用高通量红细胞血型基因的多重连接依赖探针扩增技术(MLPA)对先证者及其他成员血型基因作定性及定量分型;用PCR产物直接测序方法对发现的变异作确认.结果 血型血清学检测:先证者为Del表型,其他3名家系成员为正常的RhD阳性个体.MLPA基因分型:先证者有2条包含1227G＞A突变位点的RHD等位基因,而3名家系成员有1条包含1227G＞A突变位点的RHD等位基因及1条正常的RHD等位基因.结论 高通量红细胞血型基因分型的MLPA技术能够对Del表型作明确的基因鉴定,有助于节约宝贵的RhD阴性血液.
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Rh抗原缺失Dc-型抗体研究
目的 研究Rh抗原缺失患者血清中抗体性质和效价.方法 结合其临床表现和家系调查,利用血型血清学方法对RhDc -孕妇体内的抗体性质及效价进行分析.结果 患者血型为B、Dc-型,其亲代血清学表型为父AB、Dccee型,母O、DCCee型,患者血清中存在IgM及IgG抗-Hr0,效价分别为128、512；IgM及IgG抗-e,效价分别为16、8.结论 国内外有报道在RhD-和Rh-患者中查到1gG性质抗-Hr0,在RHDc -患者体内查出IgM和IgG性质的抗-Hr0和抗-e在国内外尚属首次报道；该患者体内RhEe缺失可能的原因为RHCE基因的遗传和变异；IgM型抗-Hr0会干扰血型检测,导致ABO正反定型不符,在临床工作中应引起注意.
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两步法分析RhD阴性及D变异体分子机制(附1例新等位基因的发现)
目的 建立用于RhD阴性及RhD变异体大标本量的快速准确的筛查方法.方法 采用血清学常规试管法初筛后,对初筛阴性标本以序列特异性引物多聚酶链反应(SSP-PCR)作两步法(第一步检测出阴性,D<'el>1227突变,以及其他变异体;第二步检定出其他变异体的具体类型)基因检测分型,并用INNO-TRAIN试剂盒作检测结果的比较,对有突变位点的变异体进行基因测序.结果 在235例初筛RhD阴性标本中,检测到1～10外显子全缺失137例,2～9外显子缺失20例,1 227G>A突变63例,845G>A突变4例,3～6外显子缺失2例,3G>A突变1例,8～9外显子缺失1例,首次发现1例3～10外显子缺失;INNO-TRAIN试剂检测及基因测序结果与之完全符合.结论 所建立的两步法基因检测分型,方法经济实用、简洁可靠,适用于大标本量筛查RhD阴性及D变异体.
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Del红细胞膜表面D抗原表位及抗原强度分析
目的 分析Del红细胞膜表面D抗原表位并测定其抗原强度.方法 采用16种针对D抗原不同表位的单克隆抗体,通过吸收放散方法检测74例Del个体红细胞膜表面D抗原表位,应用流式细胞术检测其相对抗原强度.结果 74例Del个体D抗原1～9表位检测均为阳性.D阴性、Del及D阳性红细胞相对D抗原阳性率分别为(0.97±0.18)%、(3.06±0.31)%和(99.65±0.71)%,3种表型红细胞D抗原平均荧光强度分别为13.89±2.45,24.18±3.38,223.32±13.05.结论 Del红细胞膜表面D抗原表位表达基本完整,其D抗原强度极低,仅含有微量的抗原分子数目.
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部分D表型同种抗-D1例及其基因型分析
目的 分析1名部分D表型孕妇抗.D同种免疫反应及部分D表型基因的遗传情况.方法 常规血清学方法鉴定1名部分D表型孕妇血清抗-D,然后通过RHD基因10个外显子的检测、RHD基因合子型分析、以及D抗原12个抗原表位的测定,系统鉴定该例部分D表型的类别和亚型,并对其1家3代进行遗传分析.结果 该例部分D表型为DVI(Ⅲ)类型,孕妇血清抗-D是由于妊娠Rh阳性子女产生的,效价为32,抗-D不与其自身红细胞及其它DVI(Ⅲ)部分D表型红细胞反应;家系分析表明先证者弟亦为DVI(Ⅲ)部分D表型,其父亲为隐性携带DVI(Ⅲ)部分D表型基因,而其母亲1条染色体缺失RHD基因,先证者DVI(Ⅲ)部分D表型基因未遗传至其女.结论 证实DVI(Ⅲ)部分D表型个体可被正常D抗原致同种免疫反应,同时显示个例的基因变异为家系遗传性,而非个体基因变异所致.
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Rh缺失型D - -个体及其家系成员基因分型与序列分析
目的 初步探讨Rh缺失型D--个体发生的分子机制.方法采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP),对两例Rh缺失型D--个体及其家系成员RHD与RHCE基因多个外显子与内含子进行扩增.根据PCR-SSP结果 ,对所有与血清学表型不符的异常扩增片段进行克隆测序.结果 两例Rh缺失型D--个体PCR-SSP扩增后获得D、e的基因相关片段.经测序发现,RhD--个体1第5外显子第22位核苷酸出现缺失,48与90位发生点突变.RhD--个体2第5外显子第89位发生突变.结论 Rh基因外显子的缺失以及单个核苷酸的缺失与突变可能是导致Rh缺失型DD--形成的重要原因之一.
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在中国人群中首次发现1例Rh血型弱D12型
目的分析鉴定1名RhD抗原弱阳性个体的血型血清学表型及分子背景.方法采用常规血型血清学技术检测Rh D、C、c、E、e抗原表型;采用序列特异性引物-聚合酶链反应(SSP-PCR)方法同时检测RHD基因和RHCE基因,并测序分析RHD基因全长编码区序列;同时通过特异性PCR技术测定RHD合子型或RHD基因数目.结果血型血清学试验证实该标本为D抗原弱阳性表型,与相应Rh抗血清反应为C-c+E+e+;SSP-PCR检测显示RhCcEe基因定型结果与血型血清学完全一致,且有完整的RHD基因; 但RHD基因全长编码区序列分析发现该标本的RHD第6外显子存在1处碱基突变:830G>A,编码区序列其它部分与正常RHD序列相同;RHD杂合性试验鉴定显示为RHD+/RHD-杂合型,推测该个体基因型可能为DcE/dce.结论对照国内外文献报道和GenBank记录的基因序列,该个例为在中国人群中首次发现的弱D12 型.
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RHCE基因结构研究
目的研究中国人RHCE基因结构特征.方法根据文献设计RHCE基因检测的引物,采用PCR-SSP法检测RhD阳性100例,RhD阴性300例的RHCE基因结构.结果 RHE/e和RHC/c等位基因定型结果表明,RHE/e和RHc的定型结果与血清学的一致,没有发现假阳性和假阴性.利用RHCE基因外显子1的nt48的C→G多态性检测RHC等位基因将产生6.06%的假阳性,未发现假阴性.利用109bp插入序列这一多态性来检测RHC等位基因,总的假阴性率为4.00%,没有发现假阳性.结论 RHE/e和Rhc基因定型可获得准确结果,对RHC等位基因的定型必须使用2种方法或利用至少2个以上的多态性位点.
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海南汉族RhD阴性个体RHD基因研究
目的探讨海南汉族Rh阴性献血者的RHD基因结构,为建立适合本群体的正确的RHD基因定型方法提供依据.方法采用常规盐水法和抗球蛋白法筛选RhD阴性献血者,通过吸收放散试验确定其中RhDel,并采用PCR-SSP技术分析其RHD基因存在情况,对存在全部外显子的个体进一步检测RHD内含子2、10和RHDψ假基因.结果筛选获得的106名RhD阴性个体中,31例(29.25%)为RhDel,存在完整RHD基因;剩下75例中,67例(63.21%)完全缺失RHD基因,8例缺失部分RHD基因;存在全部外显子的31例RhDel个体均存在RHD内含子2、10而无RHDψ基因.另外,在1例ccdEe样本中检测到外显子1、3、4、6、7、9及10,仅缺少外显子5.结论海南汉族RhD阴性群体中存在高比率的RhDel,且所有RhDel样本均可检测到全部的RHD基因外显子;海南汉族真实RhD阴性个体的RHD基因呈多态性,缺失部分RHD基因的个体均未检测到RHD外显子5,提示对本群体而言,特异性扩增外显子5在RHD基因定型中具有重要意义.
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中国人特异性的RHD基因定型方法的建立
目的建立特异性针对中国人的RHD基因定型方法.方法设计6对特异性针对中国人RHD等位基因的引物,并引入1对内对照引物,建立PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)方法,分6个反应管检测RHD基因.采用这一方法检测经血清学鉴定和RHD全基因序列分析的88份中国汉族人Rh阴性样本,13份Rh阳性、弱D型和部分D表型样本,以及28份D放散型(Del)样本,同时对318名随机无偿献血者作RHD基因定型,然后与血清学检测结果比较.结果所有样本的PCR-SSP检测结果均与血清学结果一致(符合率100%),并可指示目前在中国人中观察到的全部RHD基因阳性、D抗原阴性等位基因(或称无效等位基因),同时还可检出Del表型及存在于Rh阳性个体中的Del等位基因(RHD 1227A)即RHD/Del杂合型(或RHD/RHD 1227A);对318名随机个体的RHD基因检测显示后者在中国人群中的比例为8/318,Del基因在中国人群中频率即为0.012579.结论上述PCR-SSP方法简便、快速,且具有较高的准确率,可用于临床或科研进行中国人RHD基因定型或遗传分析.
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中国部分地区RhD(-)汉族人RHD基因结构分析
目的:了解RhD(-)中国汉族人RHD基因的构成情况,并探讨其潜在的应用价值.方法:采用PCR-SSP方法分析50名RhD(+)和76名常规血清学RhD(-)汉族供血者的RHD基因存在情况,对其中8例RhD(-)血样进行了吸收放散试验.结果:50名RhD(+)供者RHD基因完整存在.76名RhD(-)供者中,22名供者(28.95%)存在完整RHD基因,9名供者(11.84%)缺失大部分RHD基因,并全为中间缺失型;45名供者(59.21%)完整缺失RHD基因.携带完整RHD基因片段的RhD(-)个体表型均为CC或Cc,而无cc.吸收放散试验证实携带完整RHD基因的常规血清学RhD(-)个体中存在吸收放散弱D型(Delution,Del).结论:常规血清学RhD(-)中国人RHD基因存在多态性,提示中国汉族人RhD(-)特征有多种遗传机制,因此在临床医学中要正确对待不同遗传背景的常规血清学RhD(-)个体.
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新乡地区Rh血型资料库的建立与管理
RhD阴性属于稀有血型,中国汉族人群中仅占0.2%-0.5%[1],为了满足临床需要,本站从1998年1月开始对所有无偿献血者进行RhD阴性筛查,并以此建立了新乡地区稀有血型资料库,2000年本站建立了稀有血型库.
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RhD阴性血型血源的管理及临床应用
人类RhD血型系统是红细胞血型中仅次于ABO血型的重要系统,由于种族和地区的差异,RhD血型在分布上具有很大的差异.我国汉族人群中RhD阴性只占0.2%～0.5%,而维吾尔族占5%左右[1].维吾尔占喀什地区总人口的近90%,故相应RhD阴性血液临床使用的比率也较大.为保障临床RhD阴性血源的充足供应,本站建立了一系列管理措施.
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RhD DBT-1基因及临床分析1例
目的 分析1例D变异体DBT-1表型引起输血后产生抗D抗体的原因及分子机制.方法 用常规血清学方法确认样本RhD、C、c、E、e血型及抗体鉴定;采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)方法扩增RHD基因特异性的外显子1-10;结果 该例RhD血清学检测为阳性,Rh分型为CCee,部分D表型为DBT-1类型,输入RhDE阳性血产生抗-D及抗-E,效价分别为128和4;PCR-SSP方法扩增RHD基因特异性的外显子1-10,外显子5-7缺失,其余RHD基因外显子序列与标准序列相同.结论 证实DBT-1部分D表型个体可被正常D抗原致同种免疫反应,在输血及新生儿溶血病方面有重要意义,应提高检测水平,若需要可选择RhD阴性红细胞制品配合性输注.
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RhCE复合抗体的鉴定及特征分析1例
目的 探讨Rh血型系统CE复合抗体的鉴定及其特征.方法 对1例抗体筛查试验阳性的患者,做Rh表型分型及直接抗球蛋白试验,采用微柱凝胶卡做抗体鉴定确定抗体的特异性,同时对Rh复合抗体的特征进行文献复习.结果 患者Rh表型为DCcEe,血清中存在单一的Rh血型系统CE复合抗体,为抗-ce(抗-f、抗-RH6)复合抗体.结论 患者红细胞上缺失ce复合抗原,通过输血或妊娠免疫,产生了针对ce复合抗原的抗-ce复合抗体,而这种抗-ce复合抗体与单纯的c或e抗原均无反应性,只与ce复合抗原有反应性.
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一例抗-Ce、抗-M致交叉配血困难的分析
目的 为1例ABO血型正反定型不一致、抗体筛查阳性、重度贫血患者筛选交叉配血合适的红细胞制品,改善其贫血症状.方法 采用血型血清学方法进行ABO血型、RH血型及MNS血型鉴定试验,直接抗人球蛋白试验,不规则抗体筛查与抗体鉴定试验,抗体效价测定试验,吸收放散试验及交叉配血等试验.结果 患者血型为B型,血清中检出抗-Ce、抗-M;从368位无偿献血者中为患者筛选到C、e、M抗原均为阴性者5人(7.0U悬浮红细胞),经交叉配血相合,患者输注悬浮红细胞后,无不良反应.结论 患者体内有2种以上联合血型抗体时将增加筛配血液制品的难度和风险,为保障临床用血安全,采供血机构应建立特殊红细胞血型抗原表型无偿献血者资料库,对献血者开展定期关爱、随访、联络和保留工作,对临床紧急抢救患者生命,安全有效地输血有重要意义.
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抗-Ec检出一例
近年来由于不规则抗体所引起的配血不合日趋受到关注,其中又以Rh血型系统的相关抗体(抗-D、抗-E、抗-Ec、抗-Ce等)所引起的较为常见和具有临床意义.近期在临床患者血液样本中发现了1例不规则抗体,其特异型明显和Rh系统相关,并且出现了抗-c的漏检,现报告如下.
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多次宫内死胎史提前分娩与早期换血治疗复杂Rh血型抗体致新生儿溶血病1例
妊娠期间,由于母胎的ABO、Rh血型及其他血型的不合,可导致新生儿溶血病(hemolytic disease of newborn,HDN),严重时可导致死胎或习惯性流产.在我国,Rh血型系统导致新生儿溶血病仅次于ABO血型系统,以RhD血型不合引起的HDN为严重.在孕期如不能及早做出诊断,并积极采取预防治疗措施,可致宫内死胎、新生儿核黄疸的发生或死亡[1].本院接收诊治1例5次宫内死胎史Rh(-)孕妇,在孕34 +6周时血浆中检出IgG性质抗-D,抗-C,抗-E,其中IgG抗-D效价达1 024,经提前分娩、早期为患儿进行换血治疗获得成功,现报告如下.
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Rh血型抗体联合抗-M导致配血困难1例
由抗-M和Rh血型抗体引起的血型鉴定及交叉配血困难时有报道[1,2],但Rh血型抗体联合抗-M影响交叉配血的病例比较少见.我们在工作中遇到1例Rh血型抗体联合抗-M造成的交叉配血困难,并对其进行了详细的实验鉴定和成功配血,现报告如下.
