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分枝杆菌散在重复单位对结核分枝杆菌分型的研究
目的 评价分枝杆菌散在重复单位(MIRU)分型方法在结核病流行病学上的应用,探讨该方法的应用前景.方法 采用MIRU分型对158株结核分枝杆菌进行基因分型,这些菌株均已进行IS6110-RFLP分型.结果 MIRU分型结果产生只需1 d.158株结核分枝杆菌共产生105个类型,其中65个为独特类型.在MlRU的12个区中,重复区4、10、26、40具有较高的多态性.用Hunter-Gaston Index(HGI)对2种方法进行评价,IS6110-RFLP的分辨指数为99.4 %,MIRU技术的分辨指数为97.8%.当IS6110拷贝数小于等于10个时,IS6110-RFLP的分辨指数为98%,MIRU的分辨指数达到98.2%.结论 MIRU分型方法具有快速、简便、分辨力较高的特点,便于普及,可在结核病分子流行病学研究中发挥重要作用.
关键词： 分枝杆菌 结核 分枝杆菌散在重复单位 IS6110 RFLP -
一株在监狱系统持续蔓延的结核分枝杆菌
地点:某年末平均人口为9084名囚犯的监狱系统.目的:确定在一个较长时期内的结核病传播动力学;确定该结核杆菌株是否为监狱系统中结核病流行的主要原因;确定社区病例分离株的成簇性是否和监狱系统有联系.设计:对过去9年中监狱系统报告的结核病例进行回顾性流行病学分析.另外,将囚犯结核杆菌分离株的IS6110-RFLP图谱与其它病例进行总体比较.将RFLP分析结果与流行病学调查结果进行对照.结果:监狱系统中约80%的病例分离株成簇.在过去的9年中50%以上病例属同一结核杆菌株.社区内由同一株结核杆菌引起的病例与监狱系统存在明显关联.结论:虽然已实行了强有力的结核病控制措施,但是某结核杆菌株仍在监狱系统持续流行.在被诊断和治疗之前,其持留性可使潜伏感染复燃,并感染其他患者,从而使传播链持续下去.
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基于颜色判定的环介导恒温扩增法快速检测结核分枝杆菌
目的 建立快速检测结核分枝杆菌环介导的恒温扩增法.方法 针对结核分枝杆菌特异性保守靶序列IS6110,采用环介导的恒温扩增法(LAMP)引物设计原则设计6条引物,特异性识别靶基因序列上8个独立区域.LAMP反应过程中会产生焦磷酸镁白色沉淀,可以通过实时监测反应液浊度来判断反应结果.结果 试验表明,在60～ 65℃恒温条件下,LAMP反应60 min内即可完成；如果在反应前添加钙黄绿素,可通过反应液颜色的变化来判断反应结果；LAMP方法的低检出核酸浓度为101 pg/μl,其灵敏度是PCR方法低检出浓度1.01 ng/μl的10倍,且具有良好的特异性.结论 LAMP方法检测结核分枝杆菌具有简单、快速、价廉、特异性强、灵敏度高等特点,适用于疾控工作及临床筛查或快速检测结核杆菌.
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结核分枝杆菌IS6110和IS1081微滴数字PCR检测体系的建立和应用
目的 建立结核分枝杆菌IS6110和IS1081微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测体系,并用于不同类型临床样本的检测.方法 常规提取13株结核分枝杆菌和14株非结核分枝杆菌临床分离株DNA,9例结核分枝杆菌阳性肺结核患者和4例其他肺部疾病患者痰DNA,12例结核分枝杆菌阳性肺结核患者和7例健康者血浆DNA.设计合成IS6110和IS1081扩增引物和检测探针,建立ddPCR检测体系.应用该体系检测分枝杆菌、痰和血浆3种DNA样本中靶标拷贝数,进行统计学分析.结果 建立了能同时检测IS6110和IS1081的ddPCR体系,该体系检测2个靶标的线性范围分别为0.5～8 733和0.2～2 893拷贝/μl反应体系.该体系具有较好的重复性(r＞0.95),以非结核分枝杆菌为对照检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异度均为100％.在痰和血浆DNA样本检测中,2个靶标拷贝数在肺结核组均显著高于对照组.结论 结核分枝杆菌特异性核酸的ddPCR体系,可用于肺结核患者临床分离株、痰和血浆样本的微量核酸检测,对提高结核病病原学诊断能力有重要意义.
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巢式PCR扩增IS6110技术用于诊断结核病的实验研究
目的:探讨巢式聚合酶链反应(PCR)技术在部队结核病患者诊断中的实用价值.方法:根据结核分枝杆菌特有的插入序列IS6110基因序列,设计内外引物组成套式PCR,用于结核分枝杆菌DNA的检测,并与Bactec快速培养法和涂片抗酸染色镜检法比较.结果:套式PCR对分枝杆菌参考菌株的检测,仅人型和牛型结核分枝杆菌呈阳性.检测24例非结核病患者痰标本呈阴性.以巢式-PCR,Bactec快速培养法和抗酸染色涂片法分别检测116份可疑结核病患者痰标本,阳性率分别为67.2%,40.5%,37.1%.培养与涂片阳性者,PCR检测均呈阳性,巢式-PCR检出率明显高于后两法结果,且有显著性差异(P＜0.01).结论:巢式-PCR用于部队结核病患者的实验室诊断,具有灵敏、特异、准确、快速的特点,有较好的实用价值.
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分子信标荧光定量PCR快速检测结核分枝杆菌方法的初步研究
目的 建立分子信标荧光定量PCR快速检测结核杆菌方法,为临床结核病的诊断提供特异性强、灵敏度高、可标准化、自动化的检测方法.方法 根据GenBank数据库公布的结核分枝杆菌IS6110基因的保守序列,设计引物与分子信标探针,建立结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法;以10种细菌作对照分析该方法的特异性与灵敏度;应用已建立的方法检测结核分枝杆菌,评价其应用价值.结果 所建立的分子信标荧光定量PCR检测10种细菌,只有结核分枝杆菌有荧光信号,与其他细菌无交叉反应,4拷贝/PCR反应体系的结核分枝杆菌都能有效检出.对100株结核分枝杆菌的检测结果为阳性,单一检测时间仅需2 h.结论 分子信标荧光定量PCR检测方法快速、灵敏度高、特异性强,可用于快速诊断结核病,为结核病的诊断与治疗提供新的检测手段.
