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PDGF-B链基因上游序列中与HMGI结合A-T丰富区的初步分离和鉴定
一些动脉粥样硬化相关致病因素可诱导内皮细胞和单核细胞中血小板源生长因子-B链(PDGF-B)基因表达,这一过程涉及众多反式作用因子和基因上游调控序列之间的相互作用.染色体结合蛋白--高迁移率蛋白Ⅰ(HMGI)可通过与DNA上的A-T丰富区结合,影响多种基因的转录.目的:分离和鉴定PDGF-B链基因上游序列中与HMGI结合的A-T丰富区,并初步分析其功能.方法:DNA重组技术和凝胶迁移率改变法(EMSA).结果:重组人HMGI蛋白(rHMGI)可与PDGF-B链基因上游序列结合.在-1758/+43 bp片段内至少存在两个与HMGI结合的A-T丰富区,其中一个位于-190/+43 bp片段内,可能是涉及TATA盒在内的TTTATAAA,另一个位于-1304/-990 bp内,该区有两个TTTATAAA序列.被蛋白激酶C和CDC2激酶磷酸化的rHMGI与-1304/990 bp片段内A-T丰富区的结合活性明显减低,但未观察到PKC磷酸化明显减弱rHMGI与-190/+43 bp片段的结合.在肿瘤坏死因子α(TNFα),弱氧化低密度脂蛋白(mmLDL)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)处理的ECV304核抽提物中,加入低剂量的rHMGI显著增强核转录因子NF-κB与PDGF-B链基因上游切应力反应元件(SSRE)的结合,并呈一定的剂量依赖性.结论:高迁移率蛋白Ⅰ可与PDGF-B链基因上游一个或数个A-T丰富区结合,促进转录因子NF-κB与SSRE的相互作用,并可能受蛋白激酶C和CDC2激酶的磷酸化调节.这对深入阐明致动脉粥样硬化相关因素诱导PDGF-B链基因转录的机制具有重要意义.
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TNFα对血管内皮细胞PDGF-B链基因转录的影响
TNFα主要由巨噬细胞、T细胞和NK细胞产生,是一种在急、慢性炎症过程中均有重要作用的炎症介质.动脉粥样硬化(AS)是以动脉壁内皮结构、功能损害和平滑肌细胞增殖变化为主的慢性炎症过程.AS时TNFα合成增多,且与AS的严重程度成正比.PDGF是以二聚体(AA,BB和AB)形式存在的促分裂剂.其中,PDGF-B链由PDGF-B链基因编码,该基因mRNA在AS血管内皮细胞中表达明显增高.因此,研究在TNFα作用下,血管内皮细胞PDGF-B链基因表达调控的分子机制对于阐明动脉粥样硬化的发病机制具有重要意义.目的:本实验旨在确定人PDGF-B链基因上TNFα诱导反应元件的位置.方法:用限制性内切酶和PCR等方法对PDGF-B链基因5'上游序列进行定向删切,构建了一系列含人PDGF-B链基因不同上游序列的荧光素酶报告基因质粒.以培养的HUVEC和EVC304内皮细胞株为材料,用LipofectaminTM法转染细胞.将构建的质粒pSIS-1758/+43 Luc、pSIS-189/+43 Luc和pSIS-84/+43 Luc分别与内对照质粒pSV-β-Gal共转染培养的内皮细胞,用200 U/mL TNFα分别处理转染内皮细胞18 h,收集细胞裂解物,检测荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性,计算荧光素酶的比活性.结果:在PDGF-B链基因上游序列-1758/+43 bp和-189/+43 bp存在下,TNFα可使转染HUVEC荧光素酶表达量较对照组明显增加,前者对照组为3.43±0.01,TNFα组5.41±0.24,P>0.05 vs control;后者对照组为4.30±0.01,TNFα组7.15±0.88,P>0.01, vs control.而在PDGF-B链基因上游序列-84/+43 bp存在时,转染HUVEC荧光素酶表达量显著降低,对照组1.72±0.55,TNFα组1.90±0.69.两组无明显差异.同种方法转染EVC304内皮细胞株,结果一致.结论:TNFα促进内皮细胞PDGF-B链基因表达依赖该基因上游序列-189/+43 bp的存在,即在-189/+43 bp范围内可能存在TNFα诱导反应的顺式调控元件.
