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髓系触发受体-1基因RNAi慢病毒载体的构建及功能初步检测
目的:构建髓系触发受体-1(TREM-1)基因RNAi慢病毒载体,探讨TREM-1在脆弱类杆菌所致炎症反应中的作用.方法:根据小鼠TREM-1 mRNA序列选择4个靶序列并设计合成4对双链DNA oligo, 其两端含酶切位点黏端,同时合成1对阴性对照双链DNA oligo;将以上5对双链DNA oligo退火后连入pGCSIL-GFP载体,经PCR及测序鉴定后,将以上质粒分别与包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒.各组病毒载体转染Raw264.7细胞后,运用real-time PCR和ELISA检测TREM-1 mRNA和蛋白表达水平.实时定量PCR和ELISA观察干扰TREM-1后脆弱杆菌内毒素引发的Raw264.7细胞内毒素血症模型中TREM-1的表达变化.结果:PCR和测序证实目的双链DNA oligo片段已被准确克隆到pGCSIL-GFP载体;各质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生了高滴度的慢病毒颗粒;各组慢病毒感染Raw264.7细胞后均可以显著抑制TREM-1的表达,以pGCSIL-GFP/Lenti-1组效果明显.在脆弱杆菌内毒素引发的体外细胞内毒素血症模型中TREM-1表达明显增高,实时定量PCR表明慢病毒干扰载体能显著抑制模型中TREM-1的表达. 结论:成功构建了小鼠TREM-1基因RNAi慢病毒载体,所构建的慢病毒载体能够抑制脆弱类杆菌内毒素所诱导的TREM-1的表达.
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髓系触发受体-1的拮抗剂对大鼠肠巨噬细胞超微结构的影响
目的:探讨髓系触发受体-1(TREM-1)的拮抗剂对大鼠肠巨噬细胞超微结构的影响.方法:选择健康雄性SD大鼠分离肠巨噬细胞,鉴定完毕后分为3组,对照组未加LPS和LP17;LPS组的LPS给药浓度为1 mg/L,治疗组LPS给药浓度为1 mg/L,LP17给药浓度为0.1 mg/L.MTT法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测细胞TREM-1和TNF-α蛋白表达,电镜观察细胞超微结构.结果:大鼠肠巨噬细胞生长状态良好,免疫荧光显示为绿色荧光,CD14表达阳性,细胞分布较均匀.治疗组与对照组的细胞活力指数显著高于LPS组(P<0.05),细胞凋亡指数显著低于LPS组(P<0.05),TREM-1、TNF-α相对表达量显著低于LPS组(P<0.05),治疗组与对照组对比差异无统计学意义(P>0.05).电镜下观察对照组肠微绒毛整齐排列,巨噬细胞形态规则;LPS组发现肠巨噬细胞内出现大量凋亡小体,巨噬细胞体积增大;治疗组发现肠巨噬细胞内出现邵爱玲凋亡小体,巨噬细胞表面伪足少.结论:TREM-1特异性拮抗剂LP17能有效抑制巨噬细胞TREM-1与TNF-α的表达,减少巨噬细胞凋亡,提高细胞活力.
