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糖基化对α-晶状体蛋白的修饰和分子伴侣活性的降低
目的研究糖基化对α-晶状体蛋白分子伴侣活性的作用.方法分离牛晶状体α-晶状体蛋白,分别与0.5 mol*L-1果糖和0.5 mol*L-1葡萄糖在37℃温育,在第0、24、32天测定380nm的光吸收值和400nm非色氨酸荧光值,高压液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)和SDS-PAGE评价蛋白质交联程度,采用过氧化氢酶(catalase, CAT)和βL-晶状体蛋白的热凝聚光散射值,作为α-晶状体蛋白的分子伴侣活性指标.结果果糖和葡萄糖可导致时间依赖性α-晶状体蛋白在380 nm吸收值的增加,非色氨酸荧光值升高;HPLC和SDS-PAGE提示糖与α-晶状体蛋白形成交联复合物.果糖较葡萄糖作用明显.糖基化导致α-晶状体蛋白抑制CAT和βL-晶状体蛋白热凝聚作用降低,孵育第24天,葡萄糖组α-晶状体蛋白分子伴侣活性分别降低约12%和19%,果糖组约7%和9%.结论糖基化导致α-晶状体蛋白形成高分子聚合物、凝聚、交联,分子伴侣活性丧失,这在老化和糖尿病性白内障形成过程中起重要作用.
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阿司匹林对萘性白内障α-晶状体蛋白分子伴侣活性的保护作用
目的 探讨低剂量阿司匹林对萘性白内障α-晶状体蛋白分子伴侣活性的保护作用.方法 将45只150～160g雌性SD大鼠随机分为空白对照组(无特殊处理)、萘性白内障组(每日0.5mg/kg萘灌胃3d后改为每日1mg/kg)和阿司匹林组(萘灌胃4h后每日100mg/kg阿司匹林灌胃).应用定期图像分析和高效液相色谱(HPLC)法分离纯化α-晶状体蛋白,紫外分光光度法测定其抑制热诱导的β-L晶状体蛋白变性的能力.结果 3周时萘性白内障组晶状体开始出现混浊,程度逐步加重,阿司匹林组混浊早期进展较萘性白内障慢,6周后进展程度接近于萘性白内障组.实验2周时3组晶状体混浊程度的比较差异无统计学意义(F=0.032,P=0.969).实验第4、6、8、10周时3组晶状体混浊程度比较差异均有统计学意义(F=5031.130,P=0.000;F=115964.000,P=0.000;F=169846.500,P=0.000;F=195431.200,P=0.000),且空白对照组与萘性白内障组、空白对照组与阿司匹林组、阿司匹林组与萘性白内障组之间的差异均有统计学意义(P=0.000).阿司匹林组的α-晶状体蛋白分子伴侣活性高于萘性白内障组.结论 低剂量阿司匹林通过保护α-晶状体蛋白分子伴侣活性延缓萘性白内障大鼠晶状体混浊的进展,此作用在白内障早期尤为明显.
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ATP对α-晶状体蛋白分子伴侣功能及构象的影响
目的 探讨α-晶状体蛋白分子伴侣功能的作用机制.方法将柠檬酸合酶(CS)、盐酸胍和不同浓度的α-晶状体蛋白及3 mmol/L的ATP温育,分光光度计测定CS的活性.α-晶状体蛋白与ATP温育后用荧光分光光度计检测其荧光发射光谱. 结果α-晶状体蛋白不能使变性的CS复性,但能抑制盐酸胍诱导的CS凝聚,保护CS的失活且呈浓度依赖性.ATP可使这些作用增强.ATP浓度增高可导致α-晶状体蛋白色氨酸荧光强度降低. 结论 ATP可增强α-晶状体蛋白的分子伴侣功能且能改变α-晶状体蛋白的分子构象.
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糖皮质激素对α-晶状体蛋白分子伴侣功能的影响
目的研究糖皮质激素对α-晶状体蛋白分子伴侣功能的影响.方法凝胶过滤层析分离αL和βL-晶状体蛋白,αL-晶状体蛋白与25 mmol/L泼尼松龙-21-半琥珀酸(P-21-H)孵育20 d(37℃),分别于0、2、4、10和20 d应用βL-晶状体蛋白热聚集法测定分子伴侣活性,采用PerkinElmer LB50B荧光光度仪观察色氨酸和非色氨酸荧光值,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳监测蛋白质交联程度.结果被P-21-H修饰后的αL-晶状体蛋白分子伴侣功能显著降低.P-21-H可导致αL-晶状体蛋白色氨酸荧光强度明显降低,非色氨酸荧光强度向较长波长移位和增强,提示形成新的荧光色素物.孵育第10 d,伴侣活性已降低至约3.3%,色氨酸荧光强度殆尽,约在激发波长412 nm出现新的非色氨酸荧光强度.SDSPAGE显示糖皮质激素导致αL-晶状体蛋白明显凝聚.结论糖皮质激素对α-晶状体蛋白的修饰和伴侣活性的降低可能参与糖皮质激素诱导白内障的形成.
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紫外线辐射对α-晶状体蛋白分子伴侣活性的作用
目的研究在老化和白内障形成过程中紫外线(UV)辐射对α-晶状体蛋白分子伴侣活性的作用.方法新生Sprague-Dawley大鼠皮下注射亚硒酸钠诱导硒性白内障(SC),采用Sephacryl S-300 HR分离幼年和老年兔晶状体皮质和核以及SC大鼠α-晶状体蛋白.以α-晶状体蛋白对过氧化氢酶热凝聚的抑制作为分子伴侣活性指标,观察UV-B (300 nm)辐射α-晶状体蛋白后,其伴侣活性的变化.结果UV辐射新生和老年兔晶状体核αL-晶状体蛋白后30 h,与辐射前比较伴侣活性降低约18%和14%,而皮质的变化不显著;至100 h时,老年兔皮质、核和新生兔核αL-晶状体蛋白的伴侣活性分别下降8%、27%和23%.辐射第192 h,正常大鼠和SC晶状体αH-和αL-晶状体蛋白的伴侣活性显著降低,正常组分别下降35%和23%,SC组下降31%和10%.结论UV-B辐射可降低α-晶状体蛋白的分子伴侣活性,并呈时间依赖效应.UV辐射对老年α-晶状体蛋白分子伴侣活性影响比幼年显著,晶状体核比皮质对UV辐射敏感,αH-晶状体蛋白比αL-晶状体蛋白敏感.UV辐射可进一步降低硒性白内障α-晶状体蛋白的分子伴侣活性.
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兔α-晶状体蛋白的分子伴娘功能的研究
目的 了解兔α-晶状体蛋白是否具有分子伴娘功能。方法 凝胶过滤法分离水溶性晶状体蛋白在55℃高温条件下,观察α-晶状体蛋白是否能抑制β-low晶状体蛋白的凝集和变性;观察α-晶状体蛋白是否能抑制糖基化诱导的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的失活,均以牛血清白蛋白(BSA)作为对照。结果 α-晶状体蛋白能抑制热诱导的β-low晶状体蛋白的凝集和变性;α-晶状体蛋白亦能抑制糖基化诱导的G6PD的失活;而牛血清白蛋白却无此作用。结论 α-晶状体蛋白具有分子伴娘功能
关键词： α-晶状体蛋白 β-low晶状体蛋白 分子伴娘 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 -
α-晶状体蛋白对维持晶状体透明性的功能研究进展
α-晶状体蛋白是眼晶状体细胞质的主要成分,由小热休克蛋白家族中的αA-晶状体蛋白和αB-晶状体蛋白组成.α-晶状体蛋白具有分子伴侣活性,还有调控细胞周期、增强基因组稳定性、防止压力诱导性细胞凋亡的作用.α-晶状体蛋白相关基因突变常引起遗传性白内障,是目前儿童盲的主要原因,而α-晶状体蛋白的多种改变可导致年龄相关性白内障.了解α-晶状体蛋白的功能有助于理解晶状体的发育及其正常功能的维持,为预防及治疗α-晶状体蛋白相关性白内障提供理论依据.就白内障发生机制、遗传定位及晶状体蛋白的功能进行综述.
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年龄相关性白内障α-晶状体蛋白的分子伴侣功能
目的:研究年龄相关性白内障α-晶状体蛋白的分子伴侣功能.方法:使用Sephacryl S-300HR分离健康人透明的和年龄相关性白内障混浊的晶状体皮质和核的αL-晶状体蛋白.采用分光光度计测定αL-晶状体蛋白对过氧化氢酶(catalase,CAT)热凝聚的抑制作用.应用SDS-PAGE分析CAT与αL-晶状体蛋白在热凝聚实验中形成的复合物.结果:人αL-晶状体蛋白可特异性地抑制CAT热凝聚.透明晶状体皮质较核的抑制作用明显;白内障αL-晶状体蛋白的抑制作用明显下降,65岁以下与65岁以上、65岁以上白内障Ⅱ与Ⅳ级核之间αL-晶状体蛋白的抑制作用比较,差异均有显著性;65岁以下Ⅱ与Ⅳ级核之间比较,差异无显著性,但Ⅳ级核的抑制作用降低.SDS-PAGE显示热凝聚实验透明晶状体皮质αL-晶状体蛋白的20 kDa带在加热后0、40 min和2 h可溶部分无显著减少,62 kDa的CAT带含量逐渐减少.结论:人α-晶状体蛋白具有抑制CAT热凝聚的分子伴侣功能,白内障晶状体核的α-晶体蛋白具有年龄和混浊程度依赖性伴侣功能的降低,这在白内障形成过程中起重要作用.
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CT-B Conjugates顺行示踪显色α-晶状体蛋白对损伤后视神经纤维保护作用的实验研究
目的 观察α-晶状体蛋白对损伤后视神经纤维的保护作用.方法 将成年Long evens大鼠26只,其中10只用于提取α-晶状体蛋白,另外16只分成4组,分别为正常对照组和伤后2,4,6周组,每组4只.损伤神经后分别右眼经玻璃体腔注射浓度为1×10 -5g/L的α-晶体蛋白5 μl,左眼牛血清白蛋白5 μl,分别于伤后2,4,6周进行视神经取材.取材前48 h,在每只眼玻璃体腔中注射CT-B(霍乱毒素B亚单位)Conjugates 2.5 μl,取材固定脱水并行冰冻切片后进行激光共聚焦照相(488 nm波长光)观察.结果 CTB Conjugates标记的夹伤视神经中可见线状条索神经纤维染色,并呈现一定扭曲,夹杂点状或者小团块状染色.α-晶状体蛋白组的荧光强度显著高于牛血清白蛋白组.结论 CTB Conjugates顺染视神经示踪技术是观察和研究损伤后视神经病理变化的有效和简便的方法,α-晶状体蛋白对损伤后的视神经纤维具有保护作用.
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α-晶状体蛋白的结构和功能及基因学研究进展
α-晶状体蛋白包括αA-,αB-晶状体蛋白,是哺乳动物晶状体的主要蛋白,属于小热休克蛋白家族成员,具有分子伴侣功能,可以抑制变性蛋白质的凝聚和酶的失活.α-晶状体蛋白基因突变可导致白内障和肌病.本文对α-晶状体蛋白的分布、结构、功能以及基因学等方面综述.
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肌肽对激素诱导晶状体α-晶状体蛋白修饰的作用
目的:研究肌肽对糖皮质激素诱导的α-晶状体蛋白修饰和分子伴侣功能降低的保护作用,以及肌肽与糖皮质激素的直接反应.方法:采用SephacrylS-300HR凝胶柱分离牛αL-晶状体蛋白.αL-晶状体蛋白分别与不同浓度的泼尼松龙-21-半琥珀酸(P-21-H)及肌肽孵育不同时间.以αL-晶状体蛋白对热凝聚的抑制作为分子伴侣活性指标.采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光光度仪来监测被修饰的αL-晶状体蛋白,并观察肌肽和泼尼松龙-21-半琥珀酸作用后的光谱变化.结果:泼尼松龙-21-半琥珀酸可导致浓度和时间依赖性αL-晶状体蛋白分子伴侣活性的降低,但是肌肽加剧了这种效应.被泼尼松龙-21-半琥珀酸修饰后的较未被修饰的αL-晶状体蛋白色氨酸荧光强度显著降低,但是其非色氨酸荧光强度向较长波长移位,并呈现时间-剂量依赖的增强,提示有新的荧光色素物的形成.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示肌肽能与泼尼松龙-21-半琥珀酸迅速反应,从而抑制激素诱导的蛋白质修饰.时间依赖性的光吸收强度增加提示肌肽与泼尼松龙-21-半琥珀酸反应可能形成了新的加合物.结论:肌肽能够与泼尼松龙-21-半琥珀酸直接反应,肌肽具有潜在的抗糖皮质激素作用.
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6-磷酸果糖和核糖对α-晶状体蛋白分子伴侣活性的作用
目的:探讨糖基化对α-晶状体蛋白的修饰.方法:分离牛αL和βL-晶状体蛋白.分别与100 mmol/L 6-磷酸果糖(F6P)和核糖孵育0～25 d,于0,15和25 d监测200～600 nm波长范围的吸光度(A)值,色氨酸和非色氨酸荧光值,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白质交联物.测定αL-晶状体蛋白对加热诱导βL-晶状体蛋白凝聚的保护作为分子伴侣活性.结果:F6P和核糖对αL-晶状体蛋白的修饰,主要表现为时间依赖性的色氨酸荧光强度降低,非色氨酸荧光强度增强,交联物形成,分子伴侣活性降低,F6P较核糖的修饰作用显著.孵育4 d,F6P组伴侣活性下降约24% (P＜0.01),15 d,伴侣活性几乎殆尽,而核糖组伴侣活性下降约60% (P＜0.01).结论:糖基化可导致α-晶状体蛋白色氨酸残基内环境的构象改变,形成交联物,降低其分子伴侣活性.
