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脑源性神经生长因子经自噬对胚鼠神经元缺氧损伤的保护作用
目的 探讨脑源性神经生长因子(BDNF)对胚鼠缺氧神经元是否有保护作用及其机制是否与激活自噬有关.方法 将SD大鼠胚鼠(孕17 ～ 19 d)的大脑皮质神经元在体外进行原代细胞培养,并进行神经元鉴定.培养7～10d,选取生长良好的神经元用于前后两部分实验.1.第一部分随机分为3组,对照组:不加入药物,只作缺氧处理；3-甲基腺嘌呤组(3-MA组):提前加入不同浓度的3-MA后作缺氧处理,依次为5 mmol·L-1 3-MA组、10 mmol·L-1 3-MA组、20 mmol·L-1 3-MA组；BDNF组:提前加入不同浓度的BDNF后作缺氧处理,依次为50μg· L-1 BDNF组、100 μg·L-1 BDNF组、200 μg·L-1 BDNF组.观察不同剂量3- MA、BDNF对缺氧神经元损伤的作用.之后以细胞计数盒-8(CCK-8)测定各组细胞活力,确定干预缺氧神经元的佳药物浓度.2.第二部分分为3组,对照组:单纯缺氧,不加药物；100 μg·L-1 BDNF组:加入100 μg·L-1BDNF;10 mmol·L-1 3-MA组:加入10 mmol·L-1 3-MA.免疫蛋白印迹法检测3组缺氧神经元在不同缺氧时间点细胞自噬微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达情况,以LC3Ⅱ/actin的相对表达量判断自噬发生的程度.结果 1.免疫荧光鉴定:与未缺氧神经元比较,缺氧神经元突触回缩,细胞网状结构被破坏.2.神经元细胞活力:50 μg·L-1BDNF组缺氧神经元细胞活力强,100 μg·L-1BDNF组缺氧神经元细胞活力其次(Pa＜0.05)；随3-MA剂量加大,各剂量组神经元活力明显降低.3.免疫印迹:于缺氧1h、3h、5h,100 μg·L-1 BDNF组缺氧神经元的LC3表达量,均较对照组相应时间点明显上调(Pa＜0.05).结论 BDNF通过自噬途径对缺氧损伤神经元起保护作用.
关键词： 脑源性神经生长因子 氧气剥夺 神经元 自噬 自噬微管相关蛋白轻链3 -
饥饿诱导人胚肾细胞自噬模型的构建
目的：探讨饥饿诱导的人胚肾细胞（HEK293）自噬模型的构建。方法采用Earle's平衡盐溶液（EBSS）分别处理 HEK293细胞0、1、2、4、8 h，显微镜下观察细胞形态变化，蛋白免疫印迹法检测自噬微管相关蛋白轻链（LC）3-Ⅱ／LC3-Ⅰ和 p62的表达；双荧光 mRFP-eGFP-LC3（pt-fLC3）质粒转染 HEK293细胞24 h 后，荧光显微镜观察 EBSS 饥饿条件下细胞内红色和绿色 LC3荧光亮点的变化。结果饥饿处理后，HEK293细胞皱缩、变小变圆，蛋白免疫印迹法可检测到 LC3的蛋白表达和 LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值增加；荧光显微镜可观察到细胞内红色和绿色 LC3荧光亮点均增加。结论饥饿可成功诱导 HEK293细胞自噬，表现为 LC3蛋白表达和 LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值的增加，以及荧光显微镜下细胞内红色和绿色 LC3荧光亮点的增加。
关键词： 饥饿 自噬 自噬微管相关蛋白轻链3 p62 双荧光检测 -
脑源性神经营养因子通过PI3K/Akt/mTOR信号途径对胚鼠缺氧神经元的保护作用
目的 探讨脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)对缺氧(oxygen deprivation,OD)神经元的保护作用是否与激活自噬有关,其信号通路是否通过PI3K/Akt/mTOR途径.方法 1)建立胚鼠神经元OD损伤模型;CCK-8法观察不同浓度BDNF对OD神经元细胞活性的影响;2)检测OD神经元1,3,5h自噬微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达,情况观察BDNF对OD神经元的保护作用是否与自噬有关;3)检测p-Akt,p-mTOR,p-p70S6K以及LC3Ⅱ的表达,对比BDNF与自噬激活剂雷帕霉素(mammalian target of rapamycin,Rapamycin)对Akt/mTOR/p70S6K的影响,以及自噬被3-MA抑制后,BDNF对Akt/mTOR/p70S6K的影响.结果 1)50 μg/L BDNF可对OD神经元起保护作用(P＜0.05),100μg/L BDNF效应次之;2)BDNF和/或Rapamycin在下调p-Akt/p-mTOR/p-p70S6K表达的同时可上调LC3Ⅱ的表达;当3-MA抑制自噬后,BDNF对LC3Ⅱ的上调作用被抑制.结论 BDNF通过PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号途径激活自噬,发挥对OD神经元的保护作用.
关键词： 脑源性神经生长因子 自噬 神经元 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 自噬微管相关蛋白轻链3
