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miR-1291通过调控锌指蛋白8基因的表达对肾癌细胞周期及增殖的影响
目的 探讨微小RNA-1291(miR-1291)对肾癌细胞中锌指蛋白8(PHF8)基因表达的调控作用和对肾癌细胞周期及增殖的影响.方法 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肾癌细胞株OS-RC-2、ACHN、A498、786-O和人类近端肾小管上皮细胞HK-2中miR-1291表达水平,以表达量低的肾癌细胞株为实验对象分别转染miR-1291(miR-1291组)和miR-NC(miR-NC组).qRT-PCR检测转染后细胞中miR-1291和PHF8 mRNA的表达水平.Western blotting检测PHF8、细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)和Cyclin D1蛋白的表达水平.双荧光素酶报告基因系统检测miR-1291对PHF8转录活性的影响.流式细胞术检测细胞周期分布.四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验和集落形成实验分别检测细胞活力和增殖能力.结果 肾癌细胞株OS-RC-2、ACHN、A498、786-O和人类近端肾小管上皮细胞HK-2中miR-1291的表达量分别为0.64±0.17、0.60±0.15、0.29 ±0.08、0.63 ±0.08、1.01 ±0.17,差异有统计学意义(F=13.790,P＜0.001).与肾癌细胞株OS-RC-2、ACHN、786-O相比,A498细胞株中的miR-1291表达量低(P =0.002,P=0.006,P=0.003).转染后的miR-NC组和miR-1291组A498细胞中miR-1291表达量分别为1.00±0.03和775.25±329.91,差异有统计学意义(t=4.694,P=0.003);PHF8mRNA表达量分别为1.00 ±0.11和0.57 ±0.18,差异有统计学意义(t=4.122,P=0.006).Western blo-tting实验结果与qRT-PCR结果一致,且CDK6和Cyclin D1蛋白表达明显降低.双荧光素酶报告基因显示miR-1291可以直接作用于靶基因PHF8的3'-非翻译区,抑制荧光素酶活性.与miR-NC组比较,转染miR-1291后肾癌细胞在S期(23.40±4.29∶32.19±2.64,t=3.491,P=0.013)和G2-M期(14.38±4.05∶25.59±6.01,t=3.095,P=0.021)的细胞比例下降,在G0-G1期的细胞比例升高(62.22 ±7.56∶42.22±5.23,t=4.351,P=0.005).MTT实验显示,转染miR-1291的细胞活力明显下降.集落形成实验显示,A498细胞在miR-NC组和miR-1291组形成的集落数分别为246.64±39.94和87.34±21.93,差异有统计学意义(t =6.993,P＜0.001).结论 miR-1291在肾癌细胞株中表达显著下降,miR-1291可通过靶向干扰PHF8基因的表达显著抑制肾癌细胞的增殖,可能有助于开发新的肾癌治疗靶点.
