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人tBID蛋白的表达纯化及其偶联的新型分子探针对前列腺癌细胞的促凋亡作用研究
目的:以PQE-30为原核表达载体,构建PQE30-tBID重组表达载体,表达和纯化目的蛋白tBID,并利用金磁纳米微粒将tBID蛋白与人HER2抗体偶联成分子探针Anti HER2-GoldMag-tBID,以探究其对前列腺癌细胞的促凋亡作用.方法:根据tBID的基因序列设计特异性的上下游引物,利用普通PCR扩增目的基因tBID,构建重组表达载体PQE30-tBID,将其转化到BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE凝胶电泳和Western Blot鉴定分析,验证目的蛋白tBID的表达,并对其进行纯化.利用金磁纳米微粒与蛋白质之间的静电相互作用以及疏水相互作用,将人HER2抗体与tBID蛋白偶联在其表面,构建分子探针AntiHER2-GoldMag-tBID.流式细胞术检测该分子探针与前列腺癌PC-3细胞的特异性亲附结合能力,通过Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒分析分子探针对PC-3细胞的促凋亡作用.结果:普通PCR扩增后得到了411 bp的DNA片段,经双酶切鉴定以及菌液测序,表明重组表达载体PQE30-tBID构建成功.促凋亡蛋白tBID成功地在大肠杆菌中表达,蛋白相对分子量约15KD,经过纯化,得到了纯度较高的tBID蛋白.经过与金磁纳米微粒的偶联,成功构建出一种新型的分子探针Anti HER2-GoldMag-tBID.该分子探针可与PC-3细胞特异性结合,且经AnnexinV-FITC染色分析可见PC-3细胞发生明显凋亡,凋亡率达62.9％,与未处理组(3.79％)和对照组(4.33％)相比,具有显著的统计学差异.结论:PQE30-tBID重组表达载体能在大肠杆菌中高效表达,且成功得到了纯度较高的人促凋亡蛋白tBID.经金磁纳米微粒偶联,该蛋白能够与人HER2抗体重组成新型的分子探针,且能特异性地靶向前列腺癌PC-3细胞并显著促进其凋亡.
关键词： tBID 细胞凋亡 原核表达 人表皮生长因子受体2 前列腺癌 -
外源性肝细胞生长因子抗肝细胞凋亡机制的研究
目的 通过小鼠尾静脉高压注射的方法在肝细胞中建立持续、高效表达外源性肝细胞生长因子(HGF)的体系,探讨其在肝细胞凋亡中的作用机制.方法 通过尾部静脉注射pCMV-HGF质粒,检测肝组织中HGF表达的高峰.实验动物分为模型组、pcDNA3保护组、pCMV-HGF质粒保护组和生理盐水对照组,Western blot检测tBid、细胞色素C在各组肝细胞质及线粒体.中的表达情况.结果 在小鼠尾静脉快速大量注射质粒4 h后肝脏中即有外源性HGF表达,8 h达高峰.D-GalN/LPS可诱导明显的细胞凋亡,pCMV-HGF保护组tBid及细胞色素C的表达明显减少.结论 通过小鼠尾静脉高压注射的方法在肝细胞中建立持续表达外源性HGF的体系,通过抑制Bid的活性片段tBid表达和细胞色素C释放来减轻凋亡蛋白的激活.
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重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用
目的:构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,并探讨其对骨肉瘤E10细胞的促调亡作用.方法:通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪(FCM)检测E10细胞膜表面HER2的表达.将抗HER2单链抗体基因e23sFv与铜绿假单胞菌外毒素PE的转膜结构域基因(PEⅡ)和tBid基因连接,构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,将其克隆入真核表达载体pCMV中构建重组pCMV-ScFv/tBid载体,转染骨肉瘤E10细胞.间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化,Annexin V染色流式细胞术及TUNEL法检测E10细胞的凋亡情况.结果:流式细胞仪检测到E10细胞膜表面有HER2的表达.成功构建重组融合蛋白基因质粒 pCMV-ScFv/tBid.重组质粒转染E10细胞后,间接免疫荧光双标记染色检测到E10细胞中tBid的过表达;细胞色素C在细胞质中出现;细胞出现明显的固缩、核浓缩等形态特征.Annexin V染色后流式细胞仪检测可见实验组细胞凋亡率较对照组明显升高(16.1%vs 4.5%);TUNEL染色显示,E10细胞出现典型的凋亡特征.结论:重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid可以在转染的骨肉瘤E10细胞中表达,并诱导骨肉瘤细胞发生凋亡.
关键词： tBID 人表皮生长因子受体2 融合蛋白 骨肉瘤细胞 细胞凋亡 -
迷迭香酸抑制人多发性骨髓瘤ARH-77细胞增殖的作用机制
目的 研究迷迭香酸(rosmarinic acid,RosA)对ARH-77细胞的抑制作用及其机制.方法 采用CCK-8法检测RosA对ARH-77细胞增殖的影响,并由该结果确定实验组用药浓度分别为:20、40、80μmol·L-1,作用时间48 h;通过流式细胞术检测凋亡率;采用qPCR法检测Fas、caspase-8、caspase-9 mRNA表达;采用分光光度法检测caspase-8的活性;Western blot法检测tBid、Fas、活性caspase-3和活性caspase-9的蛋白水平.结果 RosA能明显抑制ARH-77细胞的增殖;与对照组相比:各实验组均主要发生早期凋亡(P<0.01);各实验组活性的caspase-3、caspase-9水平均明显升高(P<0.01),caspase-8 mRNA表达也明显上调,但其蛋白活性仅在RosA 80μmol·L-1时明显升高(P<0.01);在Ro-sA(40、80μmol·L-1)组,caspase-9 mRNA表达明显上调(P<0.05,P<0.01),tBid的蛋白表达也明显升高(P<0.01);Fas mRNA和蛋白表达仅在RosA 80μmol·L-1组明显升高(P<0.01).结论 RosA诱导ARH-77细胞早期凋亡而导致了增殖抑制,死亡受体途径和线粒体途径可能共同参与了RosA诱导的ARH-77细胞凋亡.
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tBid基因的表达及其对骨肉瘤SOSP-9607细胞的促凋亡作用
目的:观察tBid基因在骨肉瘤细胞中的表达及其对转染的SOSP-9607细胞的凋亡作用.方法:采用脂质体转染的方法,将tBid基因转染骨肉瘤细胞,间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达和细胞形态学变化,进一步电镜观察其超微结构改变.MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况,通过Annexin V、染色流式细胞仪检测来观察其促凋亡作用.结果:转染SOSP-9607细胞后,间接免疫荧光染色检测tBid的表达,细胞出现凋亡.电镜观察呈现出典型的凋亡特征.MTT实验发现细胞的增殖被明显抑制.Annexin V染色流式细胞仪检测可见明显的凋亡细胞,与对照组细胞(凋亡率为6%)相比,其凋亡率为35.8%.结论:tBid基因可以在转染的SOSP-9607细胞中表达,并可抑制转染细胞的生长,诱导细胞发生凋亡.
关键词： tBID 骨肉瘤SOSP-9607细胞 凋亡 -
重组tBid融合蛋白基因的构建及其在HeLa细胞中的分泌表达
目的:构建重组的Immuno-tBid基因,并检测其在HeLa细胞中的分泌表达.方法:将肿瘤表面抗原HER2的单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素PE的转膜结构域基因(PE253-364aa)和tBid基因连接,并在5'端连接前导肽基因,构建成Immuno-tBid(e 23 sFv-PEⅡ-tBid61/tBid76)基因.将其克隆到pCMV载体并转染HeLa细胞,G418筛选获得阳性克隆,Genomic-PCR和RT-PCR分别扩增相应的重组基因片段.建株的HeLa细胞培养上清进行蛋白G琼脂糖凝胶免疫沉淀,Western Blot检测.并通过间接免疫荧光染色和细胞计数观察建株的HeLa细胞生长和形态变化.结果:成功构建了重组的Immuno-tBid基因的真核表达载体(pCMV-e23sFv-PEⅡ(253-364)-tBid61/tBid76).稳定转染HeLa细胞,获得G418抗性的阳性HeLa细胞克隆,Genomic-PCR检测证实目的基因已整合到细胞基因组中.RT-PCR检测表明目的基因在RNA水平上的表达.细胞培养上清进行蛋白G琼脂糖凝胶免疫沉淀,Western Blot检测,证实建株的HeLa细胞可以通过分泌途径产生Immuno-tBid蛋白.间接免疫荧光染色和核染色结果显示,分泌Immuno-tBid蛋白的HeLa细胞呈标准的S型曲线生长,形态正常.结论:成功构建了重组的Immuno-tBid基因,建株的HeLa细胞可以通过分泌途径产生Immuno-tBid蛋白.
