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PEI-Et输送特异性shRNA对大鼠肝细胞AGT基因表达的影响
目的:研究交联小分子量聚乙烯亚胺衍生物PEI-Et对大鼠肝细胞(BRL-3A)的细胞毒性、转染效率和携带高血压相关基因血管紧张素原(AGT)短发卡RNA(shRNA)沉默AGT表达的能力.方法:MTT法检测PEI-Et/shRNA复合物对BRL-3A细胞的毒性,流式细胞术检测PEI-Et/shRNA复合物对BRL-3A细胞的转染效率,RT-PCR和Western blot检测PEI-Et/shRNA对AGT的基因沉默效果.结果:在相同质量比(w/w)时PEI-Et/shRNA的细胞毒性小于PEI25kDa/shRNA(P＜0.01),PEI-Et/shRNA在w/w为30时达到高转染效率,高于PEI 25 kDa (P＜0.01),PEI-Et/shRNA能高效沉默BRL-3A细胞中AGT基因的表达.结论:PEI-Et在BRL-3A细胞中是一种低细胞毒性、高转染效率的非病毒基因载体(与商业化的PEI 25kDa比较),能携带AGT shRNA高效沉默BRL-3A细胞中AGT基因的表达,通过用PEI-Et/AGT shRNA来抑制AGT的表达将为高血压的基因治疗提供一种新的思路.
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慢病毒介导的大鼠肝BRL-3A细胞Tmub1基因沉默及稳定感染细胞系的建立
目的:构建Tmubl基因慢病毒干扰载体,建立稳定转染细胞系,检测大鼠肝BRL-3A细胞中Tmub1基因表达的干扰效果.方法:设计并构建4对针对大鼠Tmub1基因的特异性shRNA干扰质粒,酶切鉴定、DNA测序所得质粒.将由pRSV-Rev、pMDLg-pRRE、pMD2G和pll3.7干扰质粒组成的包装系统共转染293T细胞,产生慢病毒.所得慢病毒感染大鼠正常肝细胞BRL-3A,Western Blot检测不同靶点RNAi后Tmubl蛋白表达情况,确定有效靶点.针对有效靶点大量包装慢病毒.测定病毒滴度并以适感染复数(multiplicity of infection,MOI)感染BRL-3A细胞后,G418抗生素筛选稳定感染细胞系BRL-3A/256.RT-PCR和Western Blot检测各组细胞Tmub1 mRNA和蛋白质的表达差异.结果:结果显示Tmub1 RNAi慢病毒载体构建成功,C0020Sh2-Hops-256干扰靶点RNAi效果强.成功包装Tmub1基因RNAi慢病毒,测定病毒滴度为2.3× 108TU/ml,对293T细胞的适感染复数为60.成功建立Tmub1 RNAi慢病毒载体稳定感染细胞系BRL-3A/256,且在该细胞系中Tmub1 mRNA和蛋白质表达明显降低.结论:成功构建Tmub1 RNAi慢病毒载体,有效干扰BRL-3A细胞中Tmub1 mRNA和蛋白表达；成功筛选出Tmub1RNAi慢病毒稳定感染细胞系BRL-3A/256.
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以聚乙烯亚胺为骨架的非病毒基因载体的构建及其转染大鼠肝细胞的研究
目的 构建交联聚乙烯亚胺(Polyethylenemine,PEI)衍生物PEI-Bu,研究其对大鼠肝细胞系BRL-3A的细胞毒性和转染效率.方法 以PEI 800Da为骨架,1,4-丁二醇二氯甲酸酯为连接剂制备聚合物PEI-Bu,用凝胶渗透色谱法(GPC)测定分子量,动态光散射法(DLS)测定PEI-Bu/pDNA复合物的粒径和Zeta电位,琼脂糖凝胶电泳考察其复合质粒DNA的能力.MTT法榆测PEI-Bu对BRL-3A的细胞毒性,以荧光素酶质粒作为报告基因,测定PEI-Bu/pDNA复合物在BRL-3A细胞中的转染效率.结果 GPC 测定分子量为Mw4289Da,多分散指数1.31,复合物的粒径为138-16lnm,Zeta电位为2.4-4.3mV,凝胶电泳表明在质量比大于1时 PEI-Bu 具有复合DNA的能力,在同一浓度下PEI-Bu的细胞的毒性小于PEI 25kDa (p<0.01),PEI-Bu/pDNA在质量比为5时达到高转染效率,高于PEl25kDa (p<0.01).并与Lipofectamine2000 相当 (P>0.05).结论 PEI-Bu对BRL-3A 细胞是一种低细胞毒性、高转染效率的非病毒基因载体,在肝细胞基因治疗领域中具有潜在的应用前景.
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Drp1和Mfn2在棕榈酸诱导大鼠肝细胞损伤中的作用机制及姜黄素衍生物L6H4的干预作用
目的：研究棕榈酸（PA）诱导肝细胞损伤的体外模拟非酒精性脂肪肝（NAFLD）模型中线粒体发动相关蛋白1（Drp1）和融合蛋白2（Mfn2）的作用机制以及姜黄素衍生物L6H4的保护作用。方法：①分别以不同浓度的PA、油酸（OA）和PA+姜黄素衍生物L6H4的混合培养基培养大鼠BRL-3A正常肝细胞24 h。用MTT法检测细胞活力，以筛选制作体外模拟NAFLD模型的佳PA浓度及姜黄素衍生物L6H4的干预浓度。②将细胞分为4组：对照组（CON组）、油酸组（OA组）、棕榈酸组（PA组）及姜黄素衍生物L6H4干预组（L6H4组），分别给予正常培养基、含有OA的培养基、含有PA的培养基及含有PA和姜黄素衍生物L6H4的混合培养基进行干预，24 h后收获细胞。分别用羟胺法测定总超氧化物歧化酶（T-SOD）含量、硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量、Real-time PCR及Western Blot法检测肝细胞Drp1、Mfn2、Bcl-2、Bax、Caspase-3、TNF-α mRNA及蛋白的表达。结果：①不同浓度PA对BRL-3A细胞的生长均具有一定的抑制作用，差异具有统计学意义（P＜0.05），并呈明显剂量依赖关系，0.1 mmol/L是分界点，而0.05 mmol/L OA对细胞活力无明显影响。因此选择0.05 mmol/L PA作为佳造模浓度以建立NAFLD体外模型。②当姜黄素衍生物L6H4干预浓度≤10μmol/L 时，细胞活力均高于75%，浓度＞20μmol/L时，细胞活力降至50%以下，差异具有统计学意义（P＜0.05）。10μmol/L时是分界点，因此选择5μmol/L作为后续L6H4干预浓度。③与CON组相比，PA组细胞MDA含量、Drp1、Bax、Caspase-3、TNF-α的mRNA及蛋白的表达均显著增加，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；而 T-SOD活力、Mfn2、Bcl-2的mRNA及蛋白表达则显著下降，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与PA组相比， L6H4组的MDA含量、Drp1、Bax、Caspase-3、TNF-α的mRNA及蛋白的表达均显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05），T-SOD活力、Bcl-2 mRNA及蛋白的表达显著提高，差异均具有统计学意义（P＜0.05），但Mfn2的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：姜黄素衍生物L6H4减轻PA诱导的大鼠BRL-3A正常肝细胞的损伤，其机制可能与其减少肝细胞脂质过氧化反应，抑制线粒体的分裂及其下游线粒体凋亡途径及炎症因子信号传导有关。这可能是姜黄素衍生物L6H4防治NAFLD的机制之一。
关键词： 姜黄素衍生物L6H4 BRL-3A 棕榈酸 线粒体 凋亡 -
丹酚酸B通过调控SIRT1/NF-κB/p53通路减轻缺氧/复氧诱导的大鼠肝细胞损伤
目的 探究丹酚酸 B(salvianolic acid B,Sal B)减轻缺氧/复氧(H/R)诱导的大鼠肝细胞损伤及潜在的分子机制.方法 体外培养BRL-3A大鼠肝细胞株,制备BRL-3A的H/R模型,予以Sal B干预.CCK-8检测细胞活力;微板法测转氨酶含量;ELISA测炎性因子的含量;流式细胞术测细胞凋亡水平;Western blot 和实时荧光定量 PCR(qPCR)检测SIRT1、NF-κB p65、p53、Bax、Bcl-2蛋白及mRNA表达水平.结果 H/R 诱导的大鼠肝细胞活力下降;细胞上清液中ALT、AST、TNF-α、IL-1β含量明显增多;细胞凋亡率明显升高;SIRT1和Bcl-2在蛋白及mRNA水平的表达下调,而NF-κB p65、p53和Bax在蛋白及mRNA水平的表达上调.在Sal B预处理后,细胞活力升高;细胞液中 ALT、AST、TNF-α 及IL-β的含量下降;细胞凋亡率降低;SIRT1和Bcl-2在蛋白水平及mRNA水平的表达升高,NF-κB p65、p53和Bax在蛋白水平及mRNA水平的表达降低.结论 丹酚酸B可有效减轻H/R诱导的大鼠肝细胞损伤,其机制可能与 SIRT1/NF-κB/p53通路有关系.
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钙调素依赖蛋白激酶家族Ⅱ表达调控对大鼠肝细胞BRL-3A凋亡的影响
目的 探讨钙调素依赖蛋白激酶家族Ⅱ(Calmodulin-dependent kinases casades,CaMK Ⅱ)表达调控对大鼠肝细胞BRL-3A凋亡的影响.方法 通过培养稳定传代的大鼠肝细胞BRL-3A细胞,并建立构建CaMK Ⅱγ蛋白(LV-CaMK Ⅱγ组)和CaMK ⅡγshRNA(shRNA组)的慢病毒表达体系,同时予以灌注相应的空白载体(LV-NC组、shRNA-NC组)及空白对照(CON组)形成对照,通过Western blot法检测各组CaMK Ⅱ、细胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)、凋亡诱导因子(Apoptosis inducing factor,AIF)蛋白的表达,并通过Tunel法检测大鼠肝细胞BRL-3A凋亡率.结果 LV-CaMK Ⅱγ组的CaMK Ⅱ、Cyt C、AIF的蛋白表达量较CON组显著增多(均P＜0.05);shRNA组的CaMK Ⅱ、Cyt C、AIF的蛋白表达量较CON组显著降低(均P＜0.05);而CON组、LV-NC组、shR-NA-NC组组间比较无显著差异(P＞0.05).同一时点LV-CaMKⅡγ组肝细胞凋亡比CON组多,差异有统计学意义(P＜0.05);同一时点shRNA组肝细胞凋亡比CON组少、差异有统计学意义(P＜0.05);shRNA-NC组、LV-NC组和CON组有差异但无统计学意义(P＞0.05).结论 特异性阻断CaMK Ⅱ信号通路可抑制肝细胞BRL-3A凋亡;而增强的CaMKⅡ信号通路则促进肝细胞BRL-3A凋亡.
关键词： 钙调素依赖蛋白激酶家族Ⅱ 大鼠肝细胞 BRL-3A 慢病毒 细胞凋亡
