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小鼠B7-2基因的克隆、测序及其重组质粒的构建
目的:克隆小鼠B7-2基因编码区的cDNA序列,并构建其表达载体.方法:利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,以小鼠脾细胞mRNA为模板,扩增获得B7-2基因,与pMD-18T连接做全自动测序,并利用基因重组技术构建包含B7-2基因的表达质粒pcDNA3.1-CMV-B7-2及pcDNA3.1-Egr-B7-2.结果:经测序证实获得的B7-2基因与文献报道的基本一致,并成功地构建了表达质粒.结论:成功克隆了B7-2的编码基因,并成功构建了表达载体pcDNA3.1-CMV-B7-2及pcDNA3.1-Egr-B7-2.
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海洛因对雌性大鼠催乳素基因表达的影响
目的:研究海洛因对雌性大鼠垂体催乳素(PRL)基因表达的影响.方法:50只雌性Wistar大鼠,随机分为5组(每组10只):对照组、海洛因给药3和9 d组、海洛因给药9 d后停药3和9 d组;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测垂体PRL mRNA相对含量,放射免疫分析法(RIA)检测血浆催乳素(PRL)水平.结果:给药3和9 d组及停药3 d组大鼠垂体PRL mRNA水平显著低于对照组(P＜0.01),停药9 d组PRL mRNA的水平虽低于对照组,但差异无显著性(P＞0.05);与给药9 d组相比,停药3 d组PRL mRNA水平有增高趋势,但差异无显著性(P＞0.05),停药9 d组的PRL mRNA的水平则显著高于给药9 d组(P＜0.05). 给药3和9 d组及停药3和9 d组血浆PRL显著低于对照组(P＜0.01);与给药9 d组比较,停药3 d组的血浆PRL水平仍然较低(P＜0.05),停药9 d组的PRL水平有高于给药9 d组的趋势,但差异无显著性(P＞0.05).结论:海洛因使雌性大鼠垂体PRL mRNA表达水平下降,短期停用海洛因其无法恢复到正常水平.
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小鼠白细胞介素18基因克隆、测序及重组质粒pIRES-IL18-B7.1的构建
目的:克隆小鼠白细胞介素18(mIL-18)编码区的cDNA序列并构建其表达载体.方法:利用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法,以小鼠脾细胞mRNA为模板,扩增获得全长mIL-18,与pMD18T连接作全自动测序,并利用基因重组技术构建包含mIL-18和B7.1的双基因表达质粒pIRES-IL18-B7.1.结果:经测序证实获得的mIL-18序列与文献报道完全一致,并成功构建了表达质粒.结论:成功克隆了mIL-18的cDNA,并构建了双基因表达载体pIRES-IL18-B7.1.
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PCR-反向点杂交法检测乙型肝炎病毒耐药突变基因的临床应用
目的 评估PCR-反向点杂交法在HBV耐药突变基因检测中的临床价值和应用前景. 方法 采用PCR-反向点杂交法的检测技术对488例乙肝患者的血清进行HBV多个耐药位点的检测,并同时进行病毒的基因分型. 结果 488例慢性乙肝患者的HBV,检出C型286例(58.61％),B型164例(33.61％),B+C混合型23例(4.71％),D型15例(3.07％);89例发生不同位点变异,变异率为18.24％. 结论 PCR-反向点杂交法是一种实用、直接、操作简单快捷,适合临床推广使用的HBV耐药突变基因的检测方法.
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标本预处理对HCV-RNA检测结果的影响
目的 研究血标本离体后的预处理及保存方式对HCV-RNA检测结果的影响. 方法 取20份丙肝患者未分离及已分离的血浆标本,于不同时间及不同温度保存后,采用RT-PCR法,检测标本中HCV-RNA含量.结果 抽血后1h内立即分离血浆的标本,分别保存于室温、4℃及-20℃,并于1d及1周后分别检测HCV-RNA含量,结果取对数后进行比较,差异无统计学意义.抽血后不分离血浆的标本,保存于4℃,于24h后进行检测,与已分离血浆,同样保存条件的标本检测结果取对数进行比较,结果差异有统计学意义. 结论 进行HCV-RNA检测时,为保证检测结果准确,血标本离体后应立即分离血清或血浆进行保存.
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WT1基因在NSCLC中的表达及其临床意义
目的 探讨Wilms tumor gene 1(WT1)基因在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)中的表达及其临床意义.方法 通过实时荧光定量PCR技术检测100例NSCLC组织石蜡标本及对照标本(40例癌旁组织和40例良性病变组织)中WT1基因的表达量,以对照组WT1相对表达量均值为比较标准,将癌组织WT1表达量分为高表达和低表达;分析WT1表达量与NSCLC患者临床特征、生存期之间的关系.结果 与对照组组织比较,WT1基因在NSCLC组织中高表达[(4.295 ±1.477)vs(1.001±0.002),P＜0.01].WT1基因表达在NSCLC患者病理类型[(4.132±0.576) vs (6.118±0.525)]、分化程度[(3.973 ±0.329) vs (5.683±0.383)]、TNM分期[(4.829 ±0.137) vs (5.685±0.473)]和淋巴结转移[(3.165 ±0.499) vs (5.186 ±0.618)]方面比较,差异均具有统计学意义(均P＜0.01).WT1高表达患者(WT1表达≥1.001)生存期缩短(43个月vs 59个月,P=0.002).结论 WT1基因在NSCLC组织中高表达,且高表达能够促进NSCLC分化和转移,缩短患者生存期.
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野生型和突变型小鼠前体mRNA加工因子31基因克隆及真核表达载体的构建
目的 构建野生型和突变型小鼠前体mRNA加工因子31(pre-mRNA processing factor 31,PRPF31)基因的真核表达载体.方法 通过逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增小鼠PRPF31野生型全长编码序列、体外定点突变获得331del12突变型PRPF1的cDNA编码序列,将上述两序列分别克隆入pGEM-T Easy载体,经限制性内切酶Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后,再克隆入pTracer-CMV真核表达载体,予DNA测序鉴定.结果 PCR成功扩增出野生型和突变型PRPF31基因,DNA序列分析证实两种基因的真核表达载体构建成功.结论 野生型和突变型PRPF31基因真核表达载体的构建,为研究PRPF31基因突变引起视网膜色素变性的机制奠定了基础.
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血管活性肠肽受体2亚型mRNA在鸡形觉剥夺性近视眼中的表达
目的 探讨雏鸡高度近视眼眼球后壁组织血管活性肠肽受体2亚型(vasoactive intestinal peptide receptor 2,VIPR2)mRNA的动态表达及意义.方法 选择出生1 d健康来亨雏鸡共30只,15只右眼遮盖作为实验组,分别持续遮盖1周、2周和4周;另15只双眼均未遮盖作为正常对照组.两组均采用检影验光检测屈光度;眼科A超测定活体眼轴长度;对两组3个时间段眼球后壁行逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)检测VIPR2 mRNA的动态表达.结果 实验组由实验前远视眼快速演变为高度近视眼,并随遮盖时间的延长、近视度数的加深,眼轴延长;两组眼球后壁均有VIPR2 mRNA的阳性表达;随着出生时间的延长,两组VIPR2 mRNA的表达均逐渐下降.与对照组相比,实验组VIPR2 mRNA的表达明显上调(P＜0.01).结论 形觉剥夺可导致高度近视眼;高度近视眼较正常眼VIPR2 mRNA的表达明显上调.血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)可能通过与VIPR2结合,参与了近视眼形成与发展的调控.
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一步法原位RT-PCR检测乳腺癌中SYK基因的表达
目的 探讨原位检测乳腺癌石蜡切片中SYK基因(SYK-mRNA)表达的灵敏方法,分析乳腺癌中SYK-mRNA表达的临床病理意义.方法 采用一步法原位RT-PCR检测52例乳腺浸润性导管癌、17例癌旁乳腺组织和22例乳腺纤维腺瘤组织中SDYK-mRNA的表达情况.结果 乳腺癌、癌旁乳腺组织和乳腺纤维腺瘤三种组织中分别检测到20例(38%)、17例(100%)和20例(91%)SYK-mRNA表达.SYK-mRNA在乳腺癌中的表达率降低(X2=30.64,P<0.05),且乳腺癌中SYK-mRNA的表达量也显示降低(H=35.08,P<0.05).结论 一步法原位RT-PCR是一种较灵敏的检测组织中mRNA的方法.SYK基因的表达在抑制乳腺癌的生长和转移过程中可能起着重要作用.
