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野生型和突变型人白介素13哺乳细胞表达质粒的构建1
目的:构建野生型及突变型人IL-13(hIL-13)哺乳细胞表达质粒.方法:采用融合PCR扩增人生长激素(hGH)-hIL13融合蛋白编码序列.PCR产物和pcDNA3.1表达载体经Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切处理后,将PCR产物定向插入pcDNA3.1真核表达载体中,构建质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g.将其转化到DH5α感受态细胞内进行扩增,阳性克隆鉴定,质粒抽提,进行测序验证.结果:重组质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g经测序验证,hGH-hIL13融合蛋白编码序列与实验设计一致,且已与pcDNA3.1(+)真核表达载体正确重组.结论:成功构建了哺乳细胞表达质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g,为后续野生型及突变型hIL-13哺乳细胞的重组表达奠定了基础.
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野生型和突变型人白介素13的大肠杆菌表达及活性分析
利用大肠杆菌表达野生型和突变型重组人白介素13(IL-13),以获得具有生物学活性的重组蛋白.采用PCR方法从质粒pET22b-hIL-13上扩增人成熟IL-13的编码序列.用定点突变引物扩增IL-13突变体(IL-13m)编码基因.将IL-13和IL-13m编码基因分别克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建质粒pET28a(+)-IL-13和pET28a(+)-IL-13m,然后将质粒转化到E.coli BL21(DE3)中,构建重组体,IPTG诱导重组蛋白表达.重组蛋白采用镍柱(Ni-NTA)纯化,纯化后复性,并分析其生物学活性.结果成功得到IL-13和IL-13m重组蛋白,经SDS-PAGE分析.在相对分子质量约14.6 kD的位置出现明显蛋白条带,经Western blot证实为重组hIL-13蛋白;重组蛋白主要以包涵体形式存在.纯化复性后,重组蛋白具有生物学活性.后成功获得了具有生物学活性的野生型和突变型重组人IL-13,为后续研究奠定了基础.
