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GLS和IL-12偶联重组耻垢分枝杆菌免疫效果的观察
目的:研究携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)偶联重组耻垢分枝杆菌(ATCC607)经鼻黏膜免疫小鼠后,小鼠体内的免疫状况.方法:BALB/c小鼠36只,随机分为生理盐水、pZM03、ATCC607、卡介苗(BCG)、重组ATCC607(即携带pZM03的ATCC607)、灭活重组ATCC607组;采用滴鼻法免疫小鼠,BCG组0、14天各1次,其它组0、4、14天各1次,第0天免疫后4周处死小鼠,用ELISA检测血清中IFN-γ、IL-12、IgG2a、lL-4的分泌水平和淋巴细胞PPD诱导的IFN-γ分泌水平以及肺泡灌洗液特异性SIgA的水平,用MTS法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况.结果:重组ATCC607血清中IFN-γ、IL-12水平与BCG组无明显差异但明显高于其他组(P＜0.05),IgG2a水平重组ATCC607组高于BCG组和其他组(P＜0.05),各组间IL-4水平差异无统计学意义.重组ATCC607、BCG、灭活重组ATCC607及ATCC607组用PPD均可诱导小鼠脾淋巴细胞增殖,各组间差异无显著意义,但与生理盐水和pZM03组间差异有显著意义(P＜0.05).重组ATCC607组PPD诱导淋巴细胞IFN-γ明显高于其它组(P＜0.05),与BCG组比较无显著差异.重组ATCC607等含菌组经鼻黏膜免疫可产生黏膜特异性SIgA.结论:重组ATCC607经鼻黏膜免疫小鼠后,机体特异性免疫特别是细胞免疫和黏膜免疫增强,为重组ATCC607治疗结核病的研究奠定了基础.
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重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫在小鼠体内的分布与表达
目的:探讨携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫在小鼠体内的分布与表达.方法:将携带绿色荧光蛋白(GFP)基因质粒(pUVl5)的重组耻垢分枝杆菌滴鼻BALB/c小鼠后2周,处死小鼠,观察肺、脾组织中荧光蛋白和耻垢分枝杆菌的分布;将携带GLS和IL-12质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌滴鼻免疫BALB/C小鼠3次,第1次免疫后4周,处死小鼠,用免疫组化检测肺、脾组织中GLS表达,用ELISA检测血清IL-12和肺泡灌洗液特异性SIgA的水平.结果:在BALB/c小鼠肺、脾组织中均检测到绿色荧光蛋白和耻垢分枝杆菌的分布,以及GLS的表达,并有血清IL-12水平升高和粘膜特异性SIgA的产生.结论:携带GFP的重组耻垢分枝杆菌可在肺和脾组织分布;携带GLS和IL-12的重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫小鼠后,可引起呼吸道粘膜特异性抗菌免疫,以及GLS和IL-12的体内表达,为新型疫苗的研究奠定了基础.
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GLS 3’-非编码区-荧光素酶报告质粒的构建及其活性鉴定
目的 构建颗粒溶素基因3’-非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR)-荧光素酶报告质粒,检测颗粒溶素和微小RNA(miRNA)调控位点的关联性.方法 将人工合成的GLS基因3’-UTR区序列,克隆至荧光素酶报告质粒pGL3-control;通过Targetscan5.1等软件预测可能与GLS基因3'-UTR作用的miRNA；将荧光素酶报告质粒和miRNA真核表达质粒共转染293T细胞,为防止脱靶效应,同时转染anti-mir-inhibitor和anti-mir-control,用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性.结果 用Targetscan5.1软件、PicTar软件和miRBase数据库预测交叉结果显示,miRNA(mir)-218 、mir-514 、mir-185 、mir-611均与GLS基因3'-UTR存在互补结合位点；构建的miRNA真核表达质粒和荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确；2种质粒共转染293T细胞后,miRNA-218可使荧光素酶报告质粒表达的荧光素酶活性降低75％左右(P＜0.01)；转染anti-mir-inhibitor后,荧光素酶的表达恢复到正常水平.结论 成功构建了GLS基因3’-UTR荧光素酶报告质粒,通过检测荧光素酶活性,筛选出和GLS表达相关的miRNA片段即miRNA-218,为探讨miRNA调控GLS表达机制打下实验基础.
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重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病免疫治疗效果的评价
目的 评估携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染的治疗效果,及其与临床抗痨药物疗效的比较.方法 结核分枝杆菌H37Rv感染Balb/c小鼠4周后分别用生理盐水、GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌(重组M.S)、INH+PZA和重组M.S+INH+PZA治疗,于第1次治疗后3个月,处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和INF-α的分泌水平、血清IL-12和IFN-γ分泌水平、肺泡灌洗液SIgA的水平和肺、脾组织中GLS表达,同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况.结果 重组M.s、INH+PZA和重组M.s+INH+PZA治疗组肺、脾组织荷菌量(log CFU/g)比生理盐水组显著降低.重组M.s组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于其它组.重组M.s组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于其它组.各组产生黏膜特异性SIgA明显高于未经感染组.用免疫组化检测到小鼠肺及脾组织中GKS的表达.生理盐水组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛,正常肺泡结构被破坏;其余组肺组织病变轻且局限.结论 重组M.s对小鼠结核病有一定免疫治疗作用,通过增强宿主Th1型免疫应答和GLS的抗菌活性有关;重组M.S对临床常用的抗结核药有协同作用,为结核病的综合治疗打下实验基础.
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GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌的构建及其在小鼠体内的表达
目的 构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌,并经鼻黏膜免疫观察其在小鼠体内的表达.方法 将人GLS和小鼠IL-12基因及分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到穿梭质粒pZM03,以pZM03电转化耻垢分枝杆菌,再将该重组耻垢分枝杆菌滴鼻免疫Balb/c小鼠3次,第1次免疫后4周,处死小鼠,用免疫组化检测肺、脾组织中GLS表达,用ELISA检测血清IL-12和肺泡灌洗液特异性SIgA的水平.结果 得到可表达GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌;在Balb/c小鼠肺、脾组织中均检测到重组耻垢分枝杆菌的分布,以及GLS的表达,并有血清IL-12水平升高和黏膜特异性SIgA的产生.结论 成功构建GLS和IL-12修饰的重组耻垢分枝杆菌,该重组菌经鼻黏膜免疫小鼠后,可引起呼吸道黏膜特异性抗菌免疫,以及GLS和IL-12的体内表达,为新型疫苗的研究奠定了基础.
