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DNA疫苗的作用机制
背景:1990年Wolff 等发现将RNA和DNA表达载体直接注射小鼠骨骼肌,可以检测到相应的蛋白表达,这揭示DNA可以直接用于疾病的治疗和免疫,基因疗法和DNA疫苗应运而生.随着近年来的研究发展, DNA 疫苗迅速显示出了几个显著特点(包括低成本、生产制造的简单便捷、及稳定性),使其成为未来解决全球卫生问题的有前景的方法之一.目的:从来自细菌 DNA 的先天免疫信号、DNA 疫苗直接转染组织细胞、交叉激活和交叉呈递机制、DNA疫苗直接转染APCs及细胞凋亡机制5个方面综述DNA疫苗的作用机制.方法:第一作者通过电子计算机检索2000年1月至2017年6月为止PubMed数据库及CNKI中国期刊全文数据库收录的与 DNA 疫苗有关的文献.英文检索词"DNA vaccine、gene vaccine、DNA plasmid、cross-presentation、transfection、apoptosis",中文检索词"基因疫苗、DNA疫苗、DNA质粒、交叉呈递、细胞凋亡、细胞转染",总计得到中英文文献105篇,47篇文献符合标准.结果与结论:在DNA疫苗发展的20多年里,研究人员发现人类DNA疫苗与传统蛋白疫苗相比,只能获得有限的抗体表达水平.在DNA疫苗作用机制中DNA转染组织细胞或者专职抗原呈递细胞、专职抗原呈递细胞交叉激活及交叉呈递DNA编码的抗原,同时DNA激活先天的免疫应答、诱导细胞凋亡,基于这些理论的研究为将来改善DNA疫苗的免疫效果提供理论支持.
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小鼠NGF基因治疗型DNA质粒的构建及中试工艺的优化
目的 构建小鼠NGF基因治疗型DNA质粒,并进行中试工艺的优化.方法 用SignalP 3.0 Server软件选择并设计与NGF融合的信号肽;根据哺乳动物密码子偏爱性,对小鼠NGF的编码序列进行优化;通过流加补料等方式优化中试生产工艺;体外瞬时转染测定DNA质粒的表达和体外生物学活性.结果 所构建的含有IgG/ngf的重组质粒,通过中试规模的发酵和纯化,获得了大量的高纯度重组质粒,该重组质粒可以在体外表达出具有生物学活性的NGF.结论 构建了具有与小鼠NGF相似的生物学活性的重组质粒,并建立了中试生产工艺.
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小鼠神经生长因子基因治疗型DNA质粒的质量控制
目的 对小鼠神经生长因子(NGF)基因治疗型DNA质粒进行质量控制.方法 用酶切鉴定法和PCR法进行DNA质粒的结构确认,鸡胚背根神经节法和免疫印迹测定DNA质粒表达产物的生物学活性,分光光度法测定浓度,琼脂糖凝胶电泳法和DNA-NPR-HPLC法测定纯度,气相色谱法测定乙醇和异丙醇残留量,琼脂糖凝胶电泳法测定RNA残留量,其余检测项目按<中国药典>三部(2005版)规定进行.结果 用上述方法 对原液和成品进行了检定,各项指标均符合<预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则>和<中国药典>三部(2005版)的要求.结论 所采用的质控方法 和质量标准能够保证该DNA质粒的安全、有效,可用于治疗型DNA质粒的质控.
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旋毛虫pcDNA3.1/Ts87重组质粒的构建和表达
目的构建和表达旋毛虫重组质粒.方法PCR法在旋毛虫抗原基因Ts87两端加上合适的酶切位点和KOZAK序列,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1/Ts87重组质粒.采用Lipofectamine介导的细胞外源DNA转染法,把重组质粒导入COS7细胞.分别用肌肉注射和基因枪免疫小鼠.结果和结论成功构建pcDNA3.1/Ts87重组质粒,并在COS7细胞和BALB/c小鼠体内表达.
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壳聚糖季铵盐/累托石纳米粒作为基因载体的转染活性
目的 观察壳聚糖季铵盐/累托石纳米粒载体的体内外转染活性,探讨其作为基因治疗载体的可行性.方法 采用溶液插层法合成壳聚糖季铵盐/累托石复合物(QC/REC)纳米粒,包裹绿色荧光蛋向(GFP)基因质粒DNA.透射电镜、凝胶电泳和吸附实验研究其包裹效率;转染人肝癌细胞HCCLM6,测定其转染率.通过裸裸鼠胃肠道及肌肉注射途径给药,研究其体内转染效果及安全性.结果 QC/REC可有效包裹质粒DNA,形成纳米粒的直径小于100 nm.壳聚糖季铵盐、累托石、质粒DNA质量比为1:2:1.5时,120 h的转染率近100%.体内实验中,QC/REC-DNA纳米粒胃肠道和肌肉给药,均可见到明显荧光表达,主要在胃和十二指肠表达,裸鼠未出现明显毒性反应.结论 QC/REC纳米粒有较好的转染活性和安全性,有望作为基因治疗的非病毒载体.
