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hLMO4基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位
目的 构建hLMO4真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位.方法 提取人乳腺癌MCF-7细胞的mRNA.反转录为cDNA.PCR扩增hLMO4全长编码基因,亚克隆至pCDNA3.1-myc-his A表达载体中.将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞BGC823中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-LMO4在乳腺癌MCF-7细胞内定位.结果 hLMO4全长基因序列克隆到了真核表达载体pCDNA3.1-myc-his A中.酶切鉴定片段为500bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为23KD.pEGFP-LMO4在乳腺癌MCF-7细胞内定位以细胞核为主,在细胞浆内少量表达.结论 成功的构建了hLMO4全长基因真核表达载体,pEGFP-LMO4蛋白定位于乳腺癌细胞质和核内.
关键词： hLMO4 乳腺癌 Westem blot -
pICln蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定
目的:制备特异性的抗plCln蛋白的单克隆抗体(McAb),为plCln的纯化及检测等提供必要的工具.方法:以pICln的合成肽为免疫原,对BALB/c小鼠注射免疫,将免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞NS-1进行细胞融合,用显微镜下挑选单个克隆的克隆化方法克隆化,用间接ELISA检测法进行筛选.单抗的效价、亚型及特异性用ELISA、免疫双向扩散实验和Western blot等检测.结果:获得了稳定的分泌型杂交瘤细胞株大2B7和4A3,2B7培养上清液单抗效价为1:64,属IgGl亚型,其腹水抗体效价及纯化抗体的效价分别为1:1.28×104、1:6.4×103,Westem blot及免疫耗竭实验呈现一条约40 kD)的特异性带,免疫组织化学染色显示在细胞核和细胞质中呈现阳性反应.结论:本次制备的单抗具有特异性、高效价,可应用于plCln蛋白的纯化及检测等研究.
关键词： pICln 合成肽 单克隆抗体 Westem blot -
PPARγ在垂体腺瘤组织中的表达及意义
目的 探讨过氧化物酶增生物殖体激活受体γ(PPARγ)在垂体腺瘤中的表达及意义.方法 收集27例垂体腺瘤标本,通过Westem blot方法 ,从蛋白水平检测PPARγ在27例垂体腺瘤、3例正常垂体组织、2例胶质细胞瘤中的表达.结果 PPARγ在所有垂体肿瘤组织中都有丰富表达,其表达显著高于正常垂体组织(P<0.01),在非侵袭性腺瘤和侵袭性腺瘤中的表达量分别为0.56±0.31,1.02±0.28,两者之间有显著差异(P<0.01).结论 PPARγ的表达与肿瘤大小及侵袭程度相关,表明PPARγ的表达与肿瘤的发生、发展密切相关,检测PPARγ有可能预测垂体腺瘤预后的重要指标.
关键词： PPARγ 垂体腺瘤 Westem blot 侵袭 -
GST-p16融合蛋白的表达、纯化及鉴定
目的利用GST融合基因表达系统表达、纯化及鉴定GST-p16融合蛋白.方法以质粒pM-p16为模板,扩增出p16基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1,将所构建的重组质粒pGEX-p16转化大肠杆菌BL21并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约42kD蛋白,其分子量与GST-p16融合蛋白相符.Western blot结果显示该蛋白能够被p16抗体特异性识别.结论本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GST-p16融合蛋白并可用于以后的实验研究.
关键词： p16 GST融合基因表达系统 Westem blot -
口腔鳞状细胞癌中eIF4E表达的临床意义及预后的相关性分析
目的:探讨真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)在口腔鳞状细胞癌(oscc)中的表达及临床意义.方法:采用RT-PCR、Western blot方法及免疫组化SP法检测30例OSCC新鲜组织及112例石蜡包埋组织与30例癌旁正常黏膜组织中eIF4E的表达,分析elF4E表达与临床病理特征及预后的关系.结果:RT-PCR结果表明elF4E mRNA在OSCC组织中的表达高于癌旁正常口腔黏膜(P＜0.05)；Western-blot结果显示eIF4E蛋白在OSCC中高于正常黏膜(P＜0.05)；多重比较显示,低分化和淋巴结转移病例中elF4E的表达较高(P＜0.05).Log-Rank生存分析显示elF4E蛋白低表达组和高表达组的5年生存率分别为63.9％和41.0％ (P ＜0.05)；COX多因素分析结果显示,eIF4E蛋白高表达是影响OSCC患者预后的指标之一.结论:elF4E的高表达与OSCC的发生发展及不良预后密切相关.
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GM-CSF/IL-3融合蛋白质量标准的研究和建立
目的:建立重组GM-CSF/IL-3融合蛋白的质控标准和检测方法,以用于该产品的常规质量控制.方法:用TF-1/MTT细胞增殖试验定量测定GM-CSF/IL-3融合蛋白体外生物学活性;用抗GM-CSF和IL-3的抗体分别进行WesternBlot进行鉴别试验;用C8-HPLC和SDS-PAGE测定蛋白纯度;用胰蛋白酶消化/C18-HPLC进行肽图分析;用顶空进样气相色谱法检测甲醇残留量;还原型SDS-PAGE测定融合蛋白相对分子质量;其他原液和成品检测项目参照2005年版中国药典三部的方法进行.结果:GM-CSF/IL-3融合蛋白的原液及成品与TF-1细胞的反应呈典型的S型曲线,符合四参数方程Y=(A-D)/[1+(x/C)^B)]+D,相关系数大于0.99,成品和原液的回收率均大于94%,RSD均小于20%;与GM-CSF和IL-3抗体进行的Westem Blot均为阳性;原液纯度大于95.0%;甲醇残留量小于0.005%,其他项目均符合2005年版中国药典三都要求.结论:建立的重组GM-CSF/IL-3融合蛋白质控标准和检测方法可以有效控制该制品的质量,并确保制品的安全与有效,已用于该制品的常规检定.
关键词： GM-CSF/IL-3 TF-1细胞 Westem blot 甲醇
