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GST-p16融合蛋白的表达、纯化及鉴定
目的利用GST融合基因表达系统表达、纯化及鉴定GST-p16融合蛋白.方法以质粒pM-p16为模板,扩增出p16基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1,将所构建的重组质粒pGEX-p16转化大肠杆菌BL21并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约42kD蛋白,其分子量与GST-p16融合蛋白相符.Western blot结果显示该蛋白能够被p16抗体特异性识别.结论本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GST-p16融合蛋白并可用于以后的实验研究.
关键词： p16 GST融合基因表达系统 Westem blot -
In-fusion技术构建表达、纯化钠泵α3亚单位膜外区截断性片段重组质粒
目的 构建重组pGEX-6P-1原核表达载体,表达和纯化大鼠钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区的截断性片段. 方法 利用In-fusion技术将钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区基因片段插入线性化的pGEX-6P-1载体中,转化,提取质粒,PCR鉴定;用阳性重组质粒pGEX-Trf-α3转化大肠杆菌,IPTG诱导、表达融合蛋白GST-Trf-α3.采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白, SDS-PAGE电泳分析表达产物的可溶性及含量.采用放射性配体结合法检测其生物活性.结果 PCR和基因测序分析显示大鼠钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区被成功插入pGEX-6P-1载体GST基因3′端,蛋白序列分析表明GST-Trf-α3融合蛋白总长度262个氨基酸,理论相对分子质量应约为33.22×103.IPTG诱导后,GST-Trf-α3融合蛋白的表达量为10%,多以可溶性形式存在,可溶性蛋白表达量为80.8%.SDS-PAGE结果 显示其纯度>95%.生物活性实验结果 显示GST-Trf-α3融合蛋白与3H-哇巴因具有一定的结合能力,但结合能力较弱.结论 采用In-fusion技术成功构建了表达GST-Trf-α3融合蛋白的原核表达载体,建立了纯化方法 ,获得高纯度的融合蛋白,为钠泵α3亚单位M1～M2和M3～M4膜外区功能以及其潜在的药理学作用研究获得了实验数据.
关键词： 钠泵α3亚单位 截断性片段 GST融合基因表达系统
