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人肝脏胆汁酸转运蛋白基因的克隆表达及其亚细胞定位
胆汁酸在脂肪和维生素消化吸收中发挥重要作用,当被排入小肠后约95%通过顶端钠依赖胆汁酸转运蛋白(ABST)被重吸收,其中的80%可通过牛磺胆汁酸钠共转运多肽(NTCP)被摄入肝细胞内并再次被分泌到胆汁中形成胆汁酸的肠肝循环[1].
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人类组织中TRAF3IP3基因表达的检测及转染胚肾HEK293细胞后的亚细胞定位
目的 克隆TRAF3IP3基因,明确TRAF3IP3在部分人类组织中的表达谱并鉴定其表达产物的亚细胞定位.方法采用实时定量PCR检测TRAF3 IP3基因在人体各组织中的表达情况；克隆TRAF3IP3基因开放读码框区(ORF)并构建真核亚细胞定位质粒.转染人胚肾HEK 293细胞,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位.结果 实时定量PCR证实TRAF3IP3基因在被检测的11种组织中均有表达,其中在淋巴结、脾、骨髓、胃和睾丸中的表达水平较高；成功克隆了TRAF3IP3基因ORF区并构建成为荧光定位质粒,激光共聚焦显微镜观察证实TRAF3IP3蛋白主要定位于核膜,在核周呈颗粒状分布.结论 TRAF3IP3基因在淋巴细胞富集的器官呈高表达,可能参与免疫系统的发育、成熟及调控,其表达产物在细胞内主要定位于核膜及核周胞浆.
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多基因真核表达载体的构建及其产物的亚细胞定位
目的 构建一种多基因表达载体,实现同一载体单一启动子的调控下表达多个基因以及这些基因在同一细胞不同细胞器中的定位.方法 利用存在于某些病毒核酸序列中的不同2A肽,合成1段包括2个2A肽和不同限制性内切酶位点的多肽序列,形成单一的开放读码框,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)Myc/His(B)相应的多克隆位点中,然后将带有膜定位的红色荧光蛋白(ERFP)、核定位的绿色荧光蛋白(EGFP)和胞浆定位的黄色荧光蛋白(EYFP)顺序插入2A肽之间的位点中,构建多基因真核表达载体pcDNA3.1 RGY.用脂质体转染小鼠成纤维NIH3T3细胞和人肾胚293细胞,利用流式细胞仪、荧光显微镜和共聚焦显微镜检测各种荧光蛋白的表达和亚细胞定位.结果 转染24 h后用流式细胞仪检测,可同时检测到EGFP和ERFP的表达,且两种荧光蛋白的表达率十分接近；荧光显微镜下同时观察到绿色和红色荧光；共聚焦显微镜观察到在单—细胞上同时显示3种荧光,ERFP定位在细胞膜上,EGFP在细胞核中,而EYFP在细胞质中.结论 通过串联方式将多个2A肽和基因置于同一个开放读码框中可实现在同一启动子的调控下表达多个基因.此外,在每个基因序列中加入不同的信号肽序列可将相应基因同时靶向不同的细胞器,实现同一细胞中不同的亚细胞定位.
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内皮活化相关新基因EOLA1的体外表达及亚细胞定位
目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(Endothelial-over-expressed lipopolysaccharide-associated factor 1, EOLA1)基因的体外表达和亚细胞定位,为进一步功能研究打下基础.方法通过偶联转录/翻译系统体外表达EOLA1蛋白,并用变性凝胶电泳进行产物检测;构建EOLA1-EGFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白表达质粒,转染内皮细胞后瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察EOLA1蛋白的亚细胞定位.结果体外表达的EOLA1蛋白分子量约18×103,与预测结果相符合;EOLA1蛋白主要定位于细胞浆,少量表达于细胞核.结论 EOLA1属细胞内结构蛋白,可能是参与了炎症时细胞内信号转导.
关键词： 内皮细胞 内皮细胞高表达脂多糖相关因子1 亚细胞定位 体外表达 -
WEE1B和CDC25B蛋白核浆转位调控小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂进程
目的 通过观察内外源性蛋白激酶WEE1B和蛋白磷酸酶CDC25B在小鼠1-细胞期受精卵中不同细胞时期的定位,为深入研究WEE1B和CDC25B的核浆转位机制奠定基础.方法 对小鼠超排卵获得各期受精卵后,免疫荧光观察各期受精卵内源性WEE1B和CDC25B蛋白定位;将pEGFP-CDC25B-WT和pDsRED2-N 1-WEE1B-RFP融合质粒显微注入G1期受精卵中,观察各组小鼠1-细胞期受精卵中外源性WEE1B和CDC25B蛋白亚细胞定位.结果 在小鼠1-细胞期受精卵G2/M期转换过程中,WEE1B向细胞浆转位和CDC25B向细胞核转位.结论 WEE1B和CDC25B在小鼠受精卵G2/M转换过程中存在核浆转位的动态平衡,本研究对阐明WEE1B和CDC25B调控小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂过程和生殖机理具有十分重要意义.
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Sirtuin1功能及调控研究进展
Sirtuin 1(SIRTl)是依赖于烟酰胺腺(嘿)呤二核苷酸辅酶(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)的去乙酰化酶(Sirtuins,SIRTs)家族7个成员中大的一个,是近年来研究为广泛的长寿因子.SIRT1除了对组蛋里赖氨酸残基去乙酰化修饰调节表现遗传外,SIRT1还可以调节细胞其他关键蛋白活性,控制细胞增殖、分化和细胞凋亡等生理功能.量近研究发现,SIRT1调控细胞功能除了与其酶活性水平有关,也可能风其在细胞中的定位有关.SIRT1在细胞核质之间穿梭和SIRT1活性水平及其相对应的生理功能仍需深入研究.
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类鼻疽伯克霍尔德菌BPSS1622蛋白免疫原性鉴定与亚细胞定位
目的 重组表达类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)BPSS1622蛋白并鉴定其免疫原性及亚细胞定位.方法 以pET-22b为表达载体,在大肠埃希菌BL21中表达BPSS1622蛋白;亲和层析纯化目的蛋白;用纯化后蛋白免疫新西兰兔获得抗血清;ELISA及Western blot鉴定纯化蛋白的免疫原性,并对类鼻疽杆菌BPSS1622蛋白进行亚细胞定位,探讨其生物学功能.结果 以菌株BPC006基因组DNA为模板,通过PCR获得目的基因,构建pET-22b/ BPSS1622重组质粒;转化至E.coli BL21获得工程菌株,经IPTG诱导表达、纯化得到了相对分子质量为22 000的目的蛋白;制备的抗血清ELISA效价高达1∶1 200000,并能与目的蛋白发生特异性抗原抗体反应;亚细胞定位发现BPSS1622蛋白定位于类鼻疽杆菌的胞壁及胞膜中.结论 成功克隆和表达了类鼻疽杆菌的BPSS1622蛋白,制备了免疫血清,该蛋白定位于细菌的细胞膜和细胞壁中,预测该蛋白具有ATP依赖的RNA解旋酶活性,为疾病诊断和预防奠定了基础.
关键词： 类鼻疽伯克霍尔德菌 BPSS1622蛋白 免疫血清 亚细胞定位 -
蛋白质的亚细胞定位预测研究进展
蛋白质处于特定的亚细胞位置上才能行使其功能,故研究亚细胞定位对了解蛋白质功能非常重要.随着后基因组时代的来临,蛋白质序列信息增长迅速,而利用实验手段分析蛋白亚细胞定位的不易大规模进行.近年来,通过提取蛋白质的各种特征信息,自动预测蛋白质的亚细胞定位的算法得到了较快的发展,本文拟从蛋白质特征信息的提取、预测算法和预测效果检验等方面,介绍蛋白质亚细胞定位预测领域中研究进展.
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带标签的高迁移率蛋白N2(HMGN2)重组质粒用于亚细胞定位分析
为进行HMGN2的亚细胞定位分析,提取人LAK细胞总RNA,设计合成相应引物,应用RT-PCR从其总RNA中扩增HMGN2 cDNA,以pcDNA3.1-myc-his和pEGFP-N1为载体,成功构建出HMGN2真核表达载体,转染HeLa细胞,转染效率达70%～80%,用抗六组氨酸臂的单克隆抗体经免疫细胞化学染色显示经pcDNA3.1-myc-his-HMGN2转染的HeLa细胞除细胞核外,胞浆亦明显着色,未转染的Hela细胞无论细胞核还是细胞浆均显阴性;用兔抗人HMGN2多克隆抗体进行的免疫细胞化学染色显示转染的HeLa细胞与用抗六组氨酸臂的单克隆抗体检测结果相同,而未转染的Hela细胞核内和胞浆也均有着色.用两种抗体行ELISA分析在细胞培养上清亦检测到HMGN2.激光共聚焦显微镜下观察pEGFP-N1-HMGN2转染的HeLa细胞发现绿色荧光主要在核内,但核外也同样存在.本实验结果证明HMGN2不仅存在于细胞核中,而且分布于细胞浆,亦可分泌到细胞外.
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小泛素样修饰蛋白对α-突触核蛋白线粒体亚细胞定位及α-突触核蛋白经泛素系统降解的影响
目的 探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)的小泛素样修饰蛋白1(small ubiquitin-like modifier1,SUMO-1)化修饰对α-synuclein蛋白亚细胞线粒体定位及α-synuelein蛋白经泛素系统降解的影响.方法 构建野生型、A53T突变型和缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型α-synuclein真核表达质粒.将野生型、A53T突变型和K96R突变型α-synuclein真核表达质粒分别转染HEK293细胞;在转染后48 h通过应用线粒体染色剂和激光共聚焦技术,观察野生型、A53T突变型及缺失SUMO-1修饰的α-synuclein蛋白的亚细胞线粒体定位和蛋白聚集情况.在转染后48 h应用anti-ubiquitin抗体进行Western印迹分析,明确野生型、A53T突变型及缺失SUMO-1修饰的α-synuclein蛋白泛素化程度有无差别.结果 将构建所得EGFP-α-synuclein-WT、EGFP-α-synuclein-A53T、EGFP-α-synuclein-K96R真核表达质粒经双酶切鉴定及DNA测序证实;激光共聚焦结果显示野生型、A53T突变型、K96R突变型α-synuclein蛋白均广泛分布于细胞质和细胞核中,以细胞质为主,野生型、A53T型细胞可见绿色荧光物质在胞质积聚,形成强荧光斑块,K96R型胞质内绿色荧光物质聚集少;野生型、A53T突变型、K96R突变型α-synuclein均与线粒体存在共定位,A53T突变型、K96R突变型α-synuclein在SUMO-1修饰或缺失的情况下对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位无明显影响.Western印迹结果显示转染缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型α-synuclein真核表达质粒组的细胞泛素蛋白的含量与转染空质粒组相比无明显变化,转染野生型、A53T突变型α-synuclein真核表达质粒组HEK293细胞中泛素蛋白的含量减少.结论 α-synuclein基因过度表达及致病突变A53T对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位无明显影响;SUMO-1修饰对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位也无明显影响;SUMO-1对a-αsynuclein基因过度表达及A53T突变型α-synuclein细胞内泛素化蛋白数量产生影响.
关键词： α-synuclein基因 小泛素样修饰蛋白1 亚细胞定位 泛素化 帕金森病 -
AK078438基因克隆表达、组织分布和亚细胞定位
目的 研究AK078438基因的克隆表达、组织分布和在不同肿瘤细胞中的表达及该蛋白的亚细胞定位.方法 应用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)方法扩增AK078438基因的全长开放阅读框(open reading frame,ORF),原核表达系统表达,亲和层析纯化该基因的融合蛋白,半定量RT-PCR方法在mRNA水平检测该基因在正常小鼠组织、肿瘤细胞以及间充质干细胞的分布.构建该绿色荧光融合蛋白的真核载体转染细胞,观察该蛋白在细胞中的定位.结果 AK078438基因全长ORF为1065 bp,编码355个氨基酸.mRNA水平上,该基因表达于小鼠的大脑、子宫、结肠、肾脏、睾丸和骨髓,在心脏、脾脏、肺、肝脏、胃中不表达.在小鼠结肠癌细胞株C26、黑色素瘤细胞株B16、小鼠Lewis肺癌LL/2,间充质干细胞中均有表达,在小鼠肝癌细胞系Hepa,小鼠骨髓细胞瘤NS-1中不表达.该蛋白定位于细胞质中.结论 对AK078438的蛋白表达、亚细胞定位、表达谱等分析为进一步研究该基因的功能奠定了基础.
关键词： AK078438基因 表达谱 亚细胞定位 连接条结构域 -
SH2A 基因对细胞信号转导的影响及其亚细胞定位
目的研究Src同源域2(src homology 2, SH2)A基因在细胞信号转导中的作用并进行亚细胞定位.方法通过RT-PCR方法扩增SH2A cDNA编码序列,构建真核重组表达载体pcDNA 3.1-SH2A,利用脂质体转染肝癌Bel7402细胞、COS7细胞,检测蛋白酶C(protein kinase C, PKC)、酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase, TPK)、丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)活性的改变;另构建pEGEP-SH2A,转染同前,荧光显微镜观察荧光定位.结果测序结果显示真核重组表达载体pcDNA 3.1-SH2A及pEGFP-SH2A中均含有SH2AcDNA编码序列;肝癌Bel7402细胞、COS7细胞转染pcDNA 3.1-SH2A后,胞浆PKC的活性下降了40%左右,MAPK和TPK活性未见明显改变.荧光显微镜观察发现 SH2 A 基因在细胞质中表达.结论 SH2 A 基因编码蛋白在PKC信号转导通路中起抑制作用; SH2 A基因编码蛋白定位于细胞质.
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生长抑制因子1基因核定位序列-绿荧光蛋白融合表达载体的构建及表达
目的构建p33ING1b核定位序列(nuclear locating sequence, NLS)-绿荧光蛋白融合表达载体,将其转染到人胚肺纤维母细胞系MRC-5,建立稳定表达该融合蛋白的细胞模型.方法应用逆转录PCR获得p33ING1b的NLS序列,然后将NLS序列插入绿荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1的多克隆位点,构建pEGFP-C1-NLS-绿荧光蛋白融合表达载体,再用此载体转染MRC-5细胞系,观察活细胞绿荧光蛋白的亚细胞定位.结果成功构建了pEGFP-C1-NLS-绿荧光蛋白融合表达载体,由该载体表达的绿荧光蛋白-NLS肽段融合蛋白产生的绿色荧光信号全部定位于胞核部位,而空载体转染的细胞表达的绿色荧光蛋白,绿色荧光信号定位于细胞浆中.结论在活细胞内,生理情况下P33ING1b完全定位于细胞核,并且在其亚细胞定位的转运过程中,NLS肽段起着决定性作用.
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一种致遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症的新突变(Ser250Phe)的鉴定与功能分析
目的 探讨Ser250Phe突变致遗传性凝血因子Ⅶ(coagulation factorⅦ,FⅦ)缺陷的分子机制.方法 用STA-R全自动血凝分析仪检测先证者及家系成员的凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thrombinoplastin time,APTT)、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)及凝血酶时间(thrombin time,TT)；一步法及ELISA分别检测先证者及家系成员凝血因子Ⅶ活性及抗原；PCR扩增先证者及其家系成员因子7基因(factor 7 gene,F7)所有外显子及侧翼序列,直接测序分析；PCR介导质粒DNA定点诱变法构建F7 Ser250Phe突变表达质粒,将表达质粒瞬时转染HEK293细胞,一步法测定培养上清FⅦ活性及ELISA及Western印迹测定培养上清及细胞裂解液FⅦ抗原；同时将F7表达质粒与高尔基体或内质网定位的荧光质粒共转染CHO细胞进行亚细胞定位分析.结果 先证者及家系成员APTT、TT及FIB均正常,而先证者PT、FⅦ活性及抗原分别为36.5 s、4.0％及130.2 ng/mL；测序发现先证者F7基因存在g.15975G＞A(IVS6-1 G＞A)与g.16750 C＞ T(Ser250Phe)双杂合突变,其父亲为g.16750 C＞T杂合子,母亲为g.15975G＞A杂合子,妹妹不携带这两种突变；HEK293细胞上清中FⅦ250Phe活性为(4.12±0.61)％(以FⅦ250Ser载体转染细胞培养上清FⅦ活性作为100％),培养上清中FⅦ250Ser与FⅦ250Phe抗原水平分别为(37.77±2.30)ng/mL和(4.02±0.52) ng/mL;而细胞裂解液中FⅦ250Ser与FⅦ250Phe抗原水平分别为(172.45±2.25) ng/mL和(130.51±2.32) ng/mL;Western印迹分析示转染了FⅦ250Phe载体的HEK293细胞培养上清无可检测FⅦ抗原,而在细胞裂解液中检测到FⅦ抗原,与ELISA检测结果一致；在CHO细胞表达的重组FⅦ250Phe绿色荧光信号能与核周内质网红色荧光信号重合,而且也与高尔基体红色信号重合,与重组FⅦ250Ser一致.结论 复合IVS6-1G＞A与Ser250Phe突变是导致患者遗传性凝血因子Ⅶ缺乏的原因；FⅦSer250Phe突变未见报道,其能正常合成,并转运至内质网及高尔基体,但不能有效分泌至细胞外,可能于细胞内部分降解或由于半衰期缩短而分泌后迅速降解.
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P120连环蛋白及其相关转录因子kaiso与肿瘤的关系
转录因子kaiso是新近发现的BTB-POZ蛋白家族的重要成员,是Armadillo连环蛋白及细胞辅助黏附因子P120连环蛋白(P120-catenin,P120ctn)的特异性绑定伙伴,已经被证实具有转录抑制功能.P120ctn可解除kaiso介导的转录抑制作用,并且P120ctn在肿瘤中的亚细胞定位影响着kaiso蛋白的活性.Kaiso不像其他典型的POZ蛋白,其拥有双重的DNA序列识别,并且kaiso的细胞质和细胞核定位依赖于肿瘤组织的微环境.对于P120ctn来说,基于它在细胞内的定位不同,它发挥了不同的作用,比如钙粘蛋白依赖性的细胞间的粘附,肌动蛋白细胞骨架的再塑造和位于细胞核内时对kaiso活性的影响.本文就核内P120ctn和其伙伴转录因子kaiso以及他们在肿瘤基因表达调控中的角色予以综述.
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人VIGILIN N端融合蛋白的表达及亚细胞定位
目的 原核表达人VIGILIN N端基因,制备抗人VIGILIN的多克隆抗体,对人VIGILIN作亚细胞定位.方法 用PCR扩增人VIGILIN基因N端,克隆到表达载体pGEX-4T-2中,并在大肠杆菌中以IPTG诱导表达.产物经 Glutathion Sepharose 4B纯化后免疫新西兰白兔制备抗人VIGILIN N端融合蛋白抗体,采用ELISA和Western blot鉴定抗体的效价及特异性.通过细胞免疫荧光染色,观察VIGILIN在细胞中的分布.结果 在28 ℃、1 mmol/L IPTG诱导3 h的优条件下成功表达GST-VIGILIN N端融合蛋白,抗体ELISA滴度为1:16000,Western blot证实抗体特异性较高,VIGILIN在细胞质和核中均有分布,核中的分布集中在核膜内侧和靠近DAPI染色显著的区域. 结论 成功表达人VIGILIN N端融合蛋白和制备兔抗人VIGILIN抗体,并应用于亚细胞定位,为研究人VIGILIN的性质和功能奠定基础.
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重组人HMGN2多克隆抗体的制备及应用
目的制备人高迁移率非组蛋白N2(HMGN2)多克隆抗体,并用于HMGN2的亚细胞定位分析.方法提取人淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)总RNA,应用RT-PCR从其总RNA中分离HMGN2 cDNA,以pGEX-1λT为载体,构建HMGN2基因大肠杆菌表达载体.应用GST亲合层析柱分离GST-HMGN2融合蛋白,将此融合蛋白免疫新西兰兔,获得抗血清经正辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化.用ELISA法检测HMGN2抗体,免疫细胞化学染色法分析HMGN2的亚细胞分布.结果经酶切产物电泳分析和DNA序列测定证明成功构建出HMGN2基因重组原核表达载体pGEX-1λT-HMGN2.转化大肠杆菌经异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获得相对分子质量约35×103的GST-HMGN2融合蛋白.该融合蛋白免疫所得免疫血清经ELISA检测显示获得滴度为1∶2000的较高效价的兔抗人HMGN2多克隆抗体.并应用此抗体对THP-1细胞进行的免疫细胞化学染色显示,经LPS刺激后除细胞核外,胞浆亦明显着色.而且用ELISA法在细胞培养液亦检测到HMGN2.结论本实验成功制备出HMGN2特异多克隆抗体,免疫细胞化学分析初步证明在LPS刺激下HMGN2不仅分布于单核吞噬细胞核,还分布于细胞浆,并可释放到细胞外.
关键词： 高迁移率非组蛋白N2 原核表达 多克隆抗体 单核吞噬细胞 亚细胞定位 -
人TCPllL2和鼠Tcp1112基因的定位及表达的初步研究
目的 观察人TCP11L2和鼠Tcp1112基因在细胞中的表达及定位和Tcp1112基因的表达谱研究.方法 用RT-PCR法从正常人和鼠睾丸组织中分别扩增得到人TCP11L2基因和鼠Tcp1112基因的开放读码框全长cDNA并定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1质粒中,构建了pEGFP-TCP11L2和pECFP-TcP1112融合基因表达载体,然后以脂质体介导转入MDCK细胞中,荧光显微镜下观察融合基因的表达情况;RT-PCR检测鼠Tcp1112基因在组织中的表达情况.结果 在转染重组真核表达栽体pEGFP-TCPllL2、pECFP-Tcp1112的MDCK细胞中,荧光主要集中在细胞核外区域,而在转染空白载体pECFP-N1的细胞中,荧光布满整个细胞;RT-PCR检测鼠Tcp1112为多组织表达.结论 人TCP11L2和鼠Tcp1112蛋白能在MDCK细胞中高效表达,表达的蛋白定位在细胞核外区域,鼠Tcp1112的多组织表达提示该基因与鼠Tcp11基因功能的不同.
关键词： 人TCP11L2基因 鼠Tp1112基因 脂质体转染 亚细胞定位 -
LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达
[目的]构建LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体,进而观察LYRM1基因编码蛋白在细胞内的定位情况.[方法]运用RT-PCR技术从人网膜脂肪组织中分离LYRM1基因的完整编码框,将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N2,脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达情况.[结果]PCR、酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建正确.激光共聚焦显微镜下观察到pEGFP-N2转染的细胞中绿色荧光均匀分布于整个细胞,而pEGFP-LYRM1转染的细胞中绿色荧光主要集中在细胞核区域.[结论]成功构建了LYRM1绿色荧光蛋白融合载体,LYRM1编码蛋白在细胞中定位于胞核中.
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线粒体信号肽引导葡萄糖调节蛋白75-增强型绿色荧光蛋白(GRP75-EGFP)融合蛋白定位于线粒体
目的 构建葡萄糖调节蛋白75(GRP75)不同结构域、不同形式突变体与线粒体信号肽重组蛋白并鉴定其亚细胞定位.方法 通过重叠延伸PCR,将线粒体靶向信号肽序列分别与GRP75不同结构域基因拼接.利用定点突变PCR分别扩增实现62和65位氨基酸突变的磷酸化失活型、磷酸化激活型突变体、482位氨基酸突变的底物结合缺陷型突变体及三位点同时突变重组体.将上述重组基因克隆入pEGFPC1真核表达质粒,酶切和测序验证后分别用脂质体转染HeLa细胞,Western blot法检测重组蛋白表达水平,激光共聚焦显微镜观察比较重组蛋白亚细胞定位情况.结果 成功构建了线粒体信号肽融合或缺失的GRP75结构域、磷酸化失活和激活突变体、底物结合缺陷突变体真核表达质粒.各重组质粒的片段插入、位点突变、信号肽融合情况均符合设计目的,在HeLa细胞表达后产物的相对分子质量大小均符合预期.EGFP蛋白C端插入信号肽能引导下游融合的GRP75全长蛋白、结构域片段、突变体蛋白表达定位于HeLa细胞线粒体中,而缺失信号肽的对应重组蛋白则主要分布于胞质和局部核周.结论 构建了一系列GRP75重组真核表达质粒,EGFP融合信号肽能引导重组蛋白在线粒体中表达定位.
