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黄花蒿羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶基因克隆与功能研究
青蒿素是治疗疟疾的首选药物,定位于质体的MEP途径可为青蒿素在内的萜类物质的合成提供基本前体.羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶[hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase,HDR]是MEP途径后一个酶,催化HMBPP生成IPP和IPP的同分异构体DMAPP.本文克隆了黄花蒿HDR基因(AaHDR2)并进行了相关功能研究.通过对AaHDR2基因(GenBank:KX058541)和已报道的AaHDR1基因(GenBank:ADC84348.1)表达分析结果表明:AaHDR1和AaHDR2在黄花蒿腺体中表达量均远高于在根、茎、叶和花中的表达量,而且AaHDR2在花中的表达量要明显高于叶中;MeJA和ABA能够大幅度上调AaHDR1和AaHDR2的表达,而GA3仅能大幅度上调AaHDR2的表达.据AaHDR1和AaHDR2的表达分析表明,AaHDR2对青蒿素在内的萜类物质的生物合成贡献更大,因此用AaHDR2进行后续的实验研究.生物信息学分析表明,AaHDR2属于HDR家族,进一步采用功能互补在E.coli突变体MG 1655ara＜＞HDR中证明AaHDR2编码蛋白质的确具有HDR的功能.AaHDR2亚细胞定位结果显示:AaHDR2融合GFP蛋白特异性定位于叶绿体中,符合MEP途径定位于质体的事实.采用转基因技术在拟南芥中过表达AaHDR2能显著性提高叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量.因此,本文所克隆的AaHDR2是利用代谢工程技术提高萜类物质生物合成能力的一个候选基因.
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缺氧影响PTEN磷酸化和核定位
目的 观察缺氧(hypoxia)对第10号染色体缺失并与张力蛋白同源的磷酸酶(phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten,PTEN)磷酸化及核定位的影响.方法 以1% O2条件下培养的COS-7细胞为缺氧模型,在缺氧处理不同时间点0、1、8、24、32 h收集细胞,应用Western blotting方法 检测PTEN磷酸化水平及其下游信号分子磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)的表达变化;分别应用细胞核、质分离技术,共聚焦显微镜观察缺氧24 h前后PTEN亚细胞定位的变化.结果 COS-7细胞缺氧处理24 h与未缺氧对照细胞相比,PTEN磷酸化水平显著降低,p-Akt亦明显减少;细胞核中PTEN表达量则显著升高.结论 PTEN磷酸化水平和核质分布受到细胞缺氧的调节.在细胞缺氧反应中,PTEN去磷酸化而活化,通过抑制其下游分子Akt磷酸化,从而抑制缺氧诱导的细胞增殖信号通路活化;并且部分入核发挥核内PTEN功能.
关键词： 第10号染色体缺失并与张力蛋白同源的磷酸酶 缺氧 磷酸化 亚细胞定位 -
乳腺癌蛋白激酶C-β靶向治疗的研究进展
蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是一族至少包括12种不同亚型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它们的不同功能主要表现在细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤发生、血管发生和耐药性等方面[1-2],基于组织表达、亚细胞定位和底物特异性等方面的差异,PKC同工酶表现出不同的生物学行为.
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SDF-1α基因与绿色荧光蛋白融合载体的构建及亚细胞定位
目的 构建SDF-α基因与绿色荧光蛋白的融合蛋白表达载体,进而观察SDF-1α基因编码蛋白在细胞内的定位情况.方法 用EcoRI内切酶从pMD-T18-SDF-1α重组载体中酶切分离SDF-α基因的完整ORF,构建pEGFP-C1-SDF-lα的融合表达载体,脂质体转染COS-7细胞,并在荧光显微镜下观察表达的融合蛋白.结果 SDF-lα基因在COS-7细胞中高效表达,激光共聚焦的结果显示,SDF-1α基因定位在细胞质内.结论 成功构建了pEGFP-C1-SDF-1α的融合表达载体,SDF-lα基因主要在细胞质中表达.
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KKXX-motif对VKORC1亚细胞定位的影响
目的 研究细胞内质网蛋白贮留信号KKXX-motif,对维生素K环氧化物还原酶复合物亚基1(VKORC1)的亚细胞定位的作用.方法 利用点突变试剂盒构建VKORC1的KKXX突变体--VKORC1-SSXX;同时应用pEGFP载体构建VKORC1-SSXX和VKORC1-KKXX的绿色荧光融合蛋白表达质粒.瞬时转染HEK293s细胞,观察野生融合蛋白和突变融合蛋白的表达情况.结果 野生型融合蛋白荧光分布在胞浆内,而突变型融合蛋白聚集表达.结论 KKXX-motif影响了VKORC1的亚细胞定位.
关键词： VKORC1 KKXX-motif 亚细胞定位 -
南方红豆杉DXS基因的克隆与功能分析
目的 从南方红豆杉Taxus chinensis获得紫杉醇生物合成途径关键酶1-脱氧-D-木糖醇-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS)基因(TcDXS)并进行生物信息学和表达模式分析以及亚细胞定位和功能鉴定.方法 采用RACE技术获得TcDXS全长;利用qRT-PCR分析TcDXS在南方红豆杉不同部位的表达情况;采用亚细胞定位分析TcDXS在细胞中的位置;用颜色功能互补实验检测TcDXS功能.结果 获得的TcDXS由3 031个核苷酸组成,包含了2 229 bp编码区,编码742个氨基酸,其蛋白相对分子质量为79 400,等电点(pI)为7.99;qRT-PCR检测表明TcDXS在南方红豆杉的嫩叶柄中表达量高,其次是叶和皮,根和茎中的表达量较低;亚细胞定位结果表明,TcDXS定位在叶绿体中;功能互补实验结果表明,在共同转化pAC-BETA和pTrc-TcDXS的大肠杆菌菌落呈现出橘黄色.结论 TcDXS的克隆和功能分析为深入研究紫杉醇生物合成途径和实现其代谢工程奠定了基础.
关键词： 南方红豆杉 紫杉醇 1-脱氧-D-木糖醇-5-磷酸合成酶 亚细胞定位 功能验证 -
丹参中转录因子SmMYB87基因的克隆、亚细胞定位和表达分析
目的 克隆丹参Salvia miltiorrhiza中第14亚群R2R3 MYB转录因子基因SmMYB87的全长序列,并对其进行生物信息学和表达分析.方法 以丹参总RNA为模板,利用同源克隆和cDNA快速扩增(RACE)技术获得SmMYB87 cDNA全长序列.运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析,利用qRT-PCR测定SmMYB87在各器官中的表达并构建融合表达载体pTF-486-SmMYB87分析SmMYB87蛋白的亚细胞定位.结果 SmMYB87基因含有2个内含子和1个732 bp的开放阅读框(ORF),编码243个氨基酸.该基因在根、茎、叶和花中均有表达,且4个器官中的表达量没有显著差异.SmMYB87蛋白在细胞核和细胞膜上均有分布.结论 SmMYB87的序列结构和表达分析为进一步研究其在丹参中的生物学作用奠定了理论基础.
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新型卟啉类光敏剂光动力治疗肝癌的体外实验研究
目的 探讨一种新型卟啉类光敏药物对人肝癌HepG2细胞的光动力学治疗(PDT)作用及其机制.方法 实验分为4组:阴性对照组,PDT组,药物组及药物+PDT组.采用Bleaching法研究光敏药物的光稳定性;MTT法检测药物对HepG2细胞的PDT杀伤作用;荧光分光光度计检测光敏药物的细胞吸收量;激光共聚焦显微镜检测药物在癌细胞内定位;Hoechst 333342染色检测PDT后HepG2细胞死亡方式.结果 药物对光照比较稳定;单纯光照及单纯光敏药物自身均对HepG2细胞生长无任何影响(P＞0.05),但药物孵育后行激光照射对HepG2细胞有强烈的PDT杀伤作用(P＜0.05),IC50值为1.21 μmol/;细胞的药物吸收量呈显著的浓度依赖性,浓度至12.5 μmol/L时吸收量达到饱和;光敏药物分布于HepG2细胞溶酶体内;PDT后HepG2细胞死亡方式主要为凋亡.结论 新型光敏药物能够杀伤人肝癌HepG2细胞,其方式主要通过损伤溶酶体启动继发性的细胞凋亡实现的.
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14-3-3蛋白对其他功能蛋白亚细胞定位的调控作用
14-3-3蛋白是所有真核细胞均表达的一组相对分子质量为(28～33)×103的酸性蛋白,该蛋白家族成员的氨基酸序列及功能等均具有高度保守性.已在哺乳动物的细胞中发现分别由不同基因编码的7种14-3-3蛋白亚型(β、γ、ε、σ、ξ、τ、η),它们主要存在于细胞质中,可自行组装成纯合型或杂合型二聚体.
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NRP-1在胶质瘤细胞系中表达水平及亚细胞定位的鉴定
[目的]检测不同胶质瘤细胞系中神经纤毛蛋白1(neuropilin-1,NRP-1)的表达水平及亚细胞定位.[方法]传代培养人U87、U251、H4及大鼠C6胶质瘤细胞系,以人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)为阳性对照、正常大鼠脑组织为阴性对照,采用RT-PCR、Western-blotting及细胞免疫荧光技术三种检测手段从信使RNA及蛋白层面分析NRP-1在四种胶质瘤细胞系中的表达及定位.[结果]四种胶质瘤细胞系(U87、U251、H4及C6)中均有NRP-1的阳性表达,且表达水平均明显高于正常大鼠脑组织(P＜0.05);恶性程度高的U87的NRP-1表达水平明显高于恶性程度较低的U251及H4(P＜0.05);而U251及H4之间NRP-1的表达水平无明显差异(P＞0.05);细胞免疫荧光结果显示NRP-1在四种胶质瘤细胞系中均有表达,且亚细胞定位主要分布于胞膜及胞质中.[结论]本实验确定了NRP-1在U87、U251、H4及C6胶质瘤细胞系中表达水平及亚细胞定位,为今后进一步将NRP-1应用于胶质瘤鉴别诊断与分级诊断奠定了理论基础.
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DNA感受器IFI16亚细胞定位对天然免疫应答的调控作用
IFI 16（interferon-γinducible protein 16）是一种多功能蛋白，通过促进细胞凋亡和老化、抑制自噬和炎症，参与肿瘤的发生与发展。2010年，Nature immunology 首次报道，IFI 16是 DNA 感受器（DNA sensor），能识别双链 DNA 病毒并激活天然免疫反应。近三年来，Science、Nature 和 Cell 等权威杂志不断报道 IFI 16在天然免疫方面的新发现，故 IFI 16已成为该领域研究的热点。本文重点关注 IFI 16的亚细胞定位的调控对抗病毒及抗肿瘤的作用，认为调节 IFI 16的亚细胞定位可作为控制细胞天然免疫反应强弱及肿瘤细胞生存的有效措施。
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应用定量分析法与图像观察法对光敏剂细胞内分布的对比研究
目的 探讨定量分析法在光敏剂亚细胞定位研究中的应用特点,并与图像观察法进行比较. 方法 传代培养A549肺癌细胞,分别与光敏剂血卟啉单甲醚孵共同孵育2,12,24 h.选择四种特异性细胞器荧光探针Rhodamine-123、Lucifer yellow、DiOC6(3)和BODIPY分别标记细胞内线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体,倒置荧光显微镜和致冷CCD探测HMME和探针荧光图像.观察细胞中光敏剂和荧光探针各自的荧光图像并分析光敏剂在细胞中的分布特点.定量计算探针荧光高强度区域与细胞区域内的HMME荧光均量比IB/IA. 结果 图像观察法显示,孵育2,12,24 h,细胞内HMME几乎不进入细胞核,而主要弥散分布于细胞质及各细胞器.定量结果显示: A549肺癌细胞内,2 h时IB/IA由高到低为:高尔基体、溶酶体、线粒体、内质网;12 h时IB/IA由高到低为:高尔基体、溶酶体、内质网、线粒体;24 h时IB/IA由高到低为:高尔基体、内质网、溶酶体、线粒体;高尔基体组IB/IA随时间上升. 结论 应用定量分析法较图像观察法更可以准确反映出HMME在细胞内分布随着孵育时间变化的特点.
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C型尼曼一匹克病与细胞胆固醇转运
C型尼曼一匹克病(NPC)是一种致命的常染色体隐性遗传性疾病,游离胆固醇等脂类沉积于溶酶体内,导致神经系统退行性变.本文综述了NPC的细胞生化表型,神经表型,NPC1基因结构及其突变,以及NPC1蛋白的分子结构、亚细胞定位和生物学作用.
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基于氨基酸对含纤连蛋白域蛋白质亚细胞的定位预测
背景:含FN域蛋白质在促进细胞迁移、黏附、生长、分化等方面发挥了重要功能,已被广泛应用于各种新型生物材料中.研究它们的亚细胞位置有利于它们的生物功能研究和新型生物材料开发.目的:实现含纤连蛋白域蛋白质的亚细胞定位预测.方法:从UniProt数据库中随机抽取80个人类含纤连蛋白域蛋白质.计算每个蛋白质的400种氨基酸对数量并组成400维向量.分别利用支持向量机和k近邻法调用每个蛋白质的400维输入向量进行训练和测试.同时,利用jackknife检验法对测试结果进行检验.结果与结论:利用支持向量机法和k近邻法法预测含纤连蛋白域蛋白质的亚细胞定位预测准确率分别为92.5%和95.0%.说明利用支持向量机和k近邻法算法预测含纤连蛋白域蛋白质的亚细胞位置具有重要意义,有利于此类蛋白质的功能研究和新型生物材料的表面改造设计.
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羊口疮024基因的表达、多抗制备及亚细胞定位
目的 克隆表达羊口疮病毒(Orf virus,()RFV) 024基因,制备多克隆抗体,检测其免疫原性,并对其进行亚细胞定位分析.方法 根据GenBank中羊口疮病毒024基因序列设计引物,进行PCR扩增.将其亚克隆至表达载体,构建原核重组质粒pGEX-6P-1-024以及真核重组质粒pEGFP-N1-024.将原核重组质粒转化Rosetta (DE3)细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定024蛋白的表达情况.纯化后的024蛋白免疫BALB/c雌鼠,获得血清并制备多克隆抗体,进行Western-blot分析.将构建的真核质粒转染MDBK细胞,24 h后通过免疫荧光观察其在细胞中的表达及亚细胞定位.结果 SDS-PAGE结果表明,羊口疮病毒024基因在Rosetta (DE3)细胞中正确表达,大小为59 kDa.Western-blot结果表明024蛋白能与制备的多抗发生特异性反应,具有良好的反应原性.荧光显微镜下结果表明024蛋白转染MDBK细胞后主要在细胞质中表达.结论 本实验为后续深入研究()RFV 024基因功能和致病机制奠定了基础.
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新基因XTP11剪切体的克隆与亚细胞定位
[目的]克隆乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV) X蛋白反式调节基因11(XTP11)的剪切体,观察剪切体蛋白在人肝癌细胞HepG2中的定位.[方法]利用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transciptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术扩增XTP11剪切体,将目的基因片段插入克隆载体pGEM-T中,经双酶切和测序鉴定后,定向克隆至荧光表达载体pEGFP-C1中,转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察确定其亚细胞定位.[结果] XTP1剪切体的开放阅读框长度为1314 bp,编码产物为437个氨基酸残基;重组质粒在HepG2细胞中转染效率为50%, 蛋白定位于细胞浆.[结论] 转染重组表达载体的细胞内出现局限性强绿色荧光信号,推断目的蛋白位于细胞质内.XTP11剪切体的克隆和亚细胞定位为进一步从分子水平分析其生物学功能奠定基础,为阐明其在乙型肝炎病毒X蛋白致病机制中的作用提供信息.
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淋巴结转移阳性乳腺癌中Ezrin相关的上皮钙黏蛋白表达亚细胞定位的临床意义
目的：探讨Ezrin与上皮钙黏蛋白（E?cad）表达部位的相关性及其对乳腺癌淋巴结转移等病理特征的影响。方法收集淋巴结转移阳性乳腺癌组织样本94例，采用免疫组化方法检测Ezrin和E?cad的表达情况。结果 E?cad和Ezrin阳性表达率分别为45.7%和58.5%；E?cad表达于细胞膜者（E?cadm）20例，表达于细胞质者（E?cadc）23例；与Ezrin阴性组织相比，Ezrin阳性组织中E?cadc表达频率显著增高（P=0.025）；在TNM分期较高（Ⅱ~Ⅲ）的组织中E?cad表达水平显著降低（P=0.001）；在较大的肿瘤组织中，Ezrin表达水平显著增高（P=0.036），E?cadc表达频率显著高于E?cadm（P=0.013）；与E?cad（+）、Ezrin（-）、E?cadm组织相比，E?cad（-）、Ezrin（+）、E?cadc组织淋巴结转移数目显著增多（P<0.05）；乳腺癌组织特征按照E?cad（+）/Ezrin（-）、E?cad（-）/Ezrin（-）、E?cad（+）/Ezrin（+）、E?cad（-）/Ezrin（+）的顺序（P<0.001），或者E?cadm/Ezrin（-）、E?cadc/Ezrin（-）、E?cadm/Ezrin（+）、E?cadc/Ezrin（+）的顺序（P=0.007），淋巴结转移的数目均依次增多。结论在转移性乳腺癌中，Ezrin可能调节E?cad的亚细胞定位，从而协同影响乳腺癌病程，促进淋巴结转移。
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149位丝氨酸对cdc25b蛋白在小鼠卵母细胞中定位的影响
目的:探讨149位丝氨酸使cdc25b蛋白诱导减数分裂功能丧失的机制.方法:应用免疫荧光观察GV期、G2/M转换期卵母细胞中cdc25b蛋白的定位情况;应用显微注射将pEGFP-cdc25b-wt、pEGFP-cdc25b-s149a的融合质粒及空载体质粒显微注射到含有完整生发泡的小鼠卵母细胞中,观察不同显微注射组小鼠卵母细胞中蛋白亚细胞定位.结果:免疫组化结果显示GV期卵母细胞中cdc25b蛋白主要分布在细胞浆中,这与显微注射野生型cdc25b结果一致,G2/M转换期卵母细胞中可以观察到蛋白的核聚集,cdc25b-s149a在细胞核与细胞浆中均有分布.结论:看似静止的卵母细胞中cdc25b蛋白处于核浆穿梭的动态平衡,149位丝氨酸的磷酸化影响蛋白的核输出速率,从而使蛋白的定位发生改变.
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抗人LOC51255单克隆抗体的制备及亚细胞定位
目的:制备抗人LOC51255单克隆抗体,并构建pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒,了解LOC51255在人肝癌细胞株HepG2中的亚细胞定位情况,为进一步研究其功能提供实验工具和基础.方法:以纯化的重组蛋白pET28b/LOC51255为抗原,免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备LOC51255单克隆抗体,并用间接ELISA法和Western blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定;通过构建含红色荧光蛋白(pDsRed1)的pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒,转入人肝癌细胞株HepG2表达重组蛋白,并对LOC51255进行亚细胞定位.结果:成功建立2株稳定分泌抗LOC51255单克隆抗体的杂交瘤细胞株;ELISA检测抗LOC51255单克隆抗体的腹水效价分别为1∶12 800和1∶25 600.2株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1.通过Western blot实验证实,2株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性LOC51255蛋白.荧光显微镜观察发现LOC51255主要定位于HepG2细胞的细胞浆.结论:成功制备了2株效价高、特异性好的抗LOC51255单克隆抗体,制备的单克隆抗体可用于LOC51255蛋白的鉴定;亚细胞定位分析证实LOC51255主要表达于HepG2细胞的胞浆,为LOC51255的生物学功能研究奠定了基础.
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部分性发作癫痫相关SCN1A基因M145fsX148突变体的构建及亚细胞定位
目的 构建部分性发作癫痫SCN1A基因M145fsX148突变体与黄色荧光蛋白(YFP)融合基因表达载体pCMV-YFP-MuSCN1A,观察其在人类神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞中的亚细胞定位.方法 应用基因重组技术,构建YFP与部分性癫痫SCN1A基因M145fsX148融合表达质粒载体,脂质体法转染技术将其与荧光真核表达载体pECFP-ER共转入SH-SY5Y细胞,采用激光扫描共聚焦显微镜观察其亚细胞定位情况.结果 重组质粒经酶切鉴定和测序分析证实构建成功,激光扫描共聚焦显微镜显示重组真核表达载体pCMV-YFP-MuSCN1A主要在SH-SY5Y细胞胞质中表达.结论 成功构建部分性发作癫痫相关SCN1A基因M145fsX148突变体与YFP融合基因质粒载体,实验显示其在SH-SY5Y细胞胞质中表达,为该突变基因的进一步研究奠定了基础.
