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环境因素和遗传因素在帕金森病病因方面的研究进展
近年来,随着对帕金森病更广泛的研究,在其病因方面取得了一定的进展.本文就环境因素和遗传因素在帕金森病病因方面的研究进展予以综述,着重阐述环境因素和遗传因素在帕金森病发病过程中所起的作用.
关键词： 帕金森病 病因 MPTP α-synuclein基因 -
Alpha-synuclein基因多态性与痴呆的相关性研究
目的 探讨α-synuclein基因多态性、载脂蛋白E(ApoE)基因多态性和阿尔茨海默病(AD)的相关性.方法 通过使用聚合酶链反应-限制片断长度多态性方法(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)检测α-synuclein基因单核苷酸多态性(SNP)方法,在180例病理确诊的日本人痴呆患者,包括99例迟发型AD(late-onset AD,LOAD,29例路易氏体病(lewy body disease,LBD)与52例血管性痴呆(vascular demetia,VD)和99例非痴呆对照组中观察α-synuclein基因及APOE基因的多态性分布,并分析其与各痴呆类型的相关性.结果 (1)α-synuclein基因内含子3上的+8945上一2-bp(CT)D/I即缺失/插入突变多态位点的D/D基因型在AD,LBD,VD中均明显增高,尤其在LBD中具有显著性差异;(2)进行男女分层分析后发现D/D基因型在女性患者中具有显著性差异,而男性患者中无显著性差异,且风险等位基因D相关于AD,LBD,VD;(3)排除APOE基因型对AD风险的影响后发现D/D基因型患AD风险为非D/D基因型的3.04倍(95%CI:0.81-11.5).结论 α-synuclein基因内含子3(CT)D/I缺失/插入突变多态位点有意义地相关于痴呆患病风险的增加.
关键词： 阿尔茨海默病 α-synuclein基因 多态性 载脂蛋白E 风险因子 -
α-synuclein和帕金森病的关系研究进展
近年来,大量研究显示SNCA基因突变等多方面的原因可导致α-synuclein异常聚集,而其和家族型和散发型帕金森病有密切关系,但是具体机制还不清楚.病理性的α-synuclein是路易小体和路易轴突的主要成分,而后两者在脑内的沉积是帕金森病的标志.帕金森病相关基因突变引起α-synuclein的聚集,其低聚物和聚集物可能干扰正常细胞功能和促进多巴胺神经元变性.本文综述了近年来关于病理性α-synuclein参与帕金森病病理生理过程及相应干预措施的研究进展以及针对α-synuclein的治疗.
关键词： 帕金森病 α-synuclein基因 治疗 -
姜黄素对α-突触核蛋白基因突变或过表达诱导的寡聚体形成及线粒体ATP敏感性钾离子通道的影响
目的 探讨姜黄素对α-突触核蛋白(α-synuclein)寡聚体形成、线粒体膜电位及线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channels,mitoKATP)的影响.方法 构建野生型、A53T突变型α-synuclein真核表达质粒,用脂质体介导转染方式将构建好的质粒转入PC12细胞,并分别应用姜黄素(20 ìmol/L)、5-羟基葵酸盐(5-hydroxydecanoate,5-HD)进行干预;48 h后应用免疫印迹、斑点杂交检测细胞α-synuclein寡聚体形成;应用JC-1荧光探针及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测线粒体膜电位及细胞膜毒性损伤;并在姜黄素干预处理前15 min给予5-HD预处理,免疫印迹检测mitoKATP蛋白的功能亚基Kir6.2的改变,细胞膜片钳观察mitoKATP的改变.结果 将构建所得EGFP-α-synuclein-WT、EGFP-α-synuclein-A53T真核表达质粒转染PC12细胞,48 h后免疫印迹及斑点印迹结果显示,α-synuclein基因过表达或突变诱导均可促进α-synuclein寡聚体形成,姜黄素可明显减弱α-synuclein基因过表达或突变诱导的α-synuclein寡聚体形成;JC-1及LDH结果显示,与正常PC12细胞相比,转染野生型、A53T突变型组细胞LDH水平分别升高35.5％及42.3％(P＜0.05),JC-1红/绿荧光比率与正常PC12细胞相比下降60.44％、65.22％(P＜0.05),姜黄素干预后,LDH水平分别下降36.3％及23.5％(P＜0.05),红/绿荧光比率上升48.46％、50.33％(P＜0.05);转染野生型或A53T突变型α-synuclein融合表达载体组Kir6.2蛋白表达增强,早期通道电流有明显增高的趋势,随后降低,应用姜黄素干预后,α-synuclein基因过表达或突变所诱导的Kir6.2蛋白表达下调,但细胞mitoKATP通道电流增加,与转染组比较有统计学意义(P＜0.05).结论 姜黄素可抑制α-synuclein基因过度表达或突变诱导的α-synuclein寡聚体形成;姜黄素可能通过稳定线粒体膜电位阻断了α-synuclein基因过表达或突变所导致的细胞凋亡;mitoKATP通道的开放可能是α-synuclein基因过表达或A53T突变诱导细胞凋亡的自发始动保护机制,姜黄素可能通过开放mitoKATP通道拮抗α-synuclein基因过表达或突变所导致的细胞毒性,mitoKATP通道的开放程度与Kir6.2蛋白的表达不成正相关.
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小泛素样修饰蛋白对α-突触核蛋白线粒体亚细胞定位及α-突触核蛋白经泛素系统降解的影响
目的 探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)的小泛素样修饰蛋白1(small ubiquitin-like modifier1,SUMO-1)化修饰对α-synuclein蛋白亚细胞线粒体定位及α-synuelein蛋白经泛素系统降解的影响.方法 构建野生型、A53T突变型和缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型α-synuclein真核表达质粒.将野生型、A53T突变型和K96R突变型α-synuclein真核表达质粒分别转染HEK293细胞;在转染后48 h通过应用线粒体染色剂和激光共聚焦技术,观察野生型、A53T突变型及缺失SUMO-1修饰的α-synuclein蛋白的亚细胞线粒体定位和蛋白聚集情况.在转染后48 h应用anti-ubiquitin抗体进行Western印迹分析,明确野生型、A53T突变型及缺失SUMO-1修饰的α-synuclein蛋白泛素化程度有无差别.结果 将构建所得EGFP-α-synuclein-WT、EGFP-α-synuclein-A53T、EGFP-α-synuclein-K96R真核表达质粒经双酶切鉴定及DNA测序证实;激光共聚焦结果显示野生型、A53T突变型、K96R突变型α-synuclein蛋白均广泛分布于细胞质和细胞核中,以细胞质为主,野生型、A53T型细胞可见绿色荧光物质在胞质积聚,形成强荧光斑块,K96R型胞质内绿色荧光物质聚集少;野生型、A53T突变型、K96R突变型α-synuclein均与线粒体存在共定位,A53T突变型、K96R突变型α-synuclein在SUMO-1修饰或缺失的情况下对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位无明显影响.Western印迹结果显示转染缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型α-synuclein真核表达质粒组的细胞泛素蛋白的含量与转染空质粒组相比无明显变化,转染野生型、A53T突变型α-synuclein真核表达质粒组HEK293细胞中泛素蛋白的含量减少.结论 α-synuclein基因过度表达及致病突变A53T对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位无明显影响;SUMO-1修饰对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位也无明显影响;SUMO-1对a-αsynuclein基因过度表达及A53T突变型α-synuclein细胞内泛素化蛋白数量产生影响.
关键词： α-synuclein基因 小泛素样修饰蛋白1 亚细胞定位 泛素化 帕金森病 -
RNA干扰技术阻断α-synuclein基因过表达诱导的α-synuclein蛋白病理性积聚的研究
目的 构建并筛选针对帕金森病致病基因α-synuclein特异、高效的RNA干扰载体,观察应用RNA干扰技术阻断α-synuclein过表达导致α-synuclein蛋白病理性积聚的作用.方法 采用携带H1启动子的PBSHH1质粒,设计并构建针对α-synuclein基因4个可有效表达发夹状RNA的特异性α-synuclein基因干扰载体pSYNi-1、pSYNi-2、pSYNi-3、pSYNi-4,通过限制性内切酶酶切、DNA测序证实后,转染HEK293细胞,应用Western印迹、逆转录-PER观察干扰载体的有效性,筛选特异、高效的RNA干扰载体.采用脂质2000将筛选的佳α-synuelein-pBSHH1 RNA 干扰载体及野生型α-synuclein-pEGFP真核细胞表达载体共转染HEK293细胞,并设立对照组,48h后采用Axiovert200型倒置荧光显微镜、荧光免疫细胞化学观察其在细胞内的表达,HE染色观察细胞质内嗜酸性小体的形成.结果 Western印迹、逆转录-PER结果显示,pSYNi-1载体具有高效的RNA干扰抑制作用,效率达69.6%;将α-synuclein-pBSHH1 RNA干扰载体pSYNi-1及野生型α-synuclein-pEGFP真核细胞表达载体转染HEK293细胞,48h后荧光显微镜下观察细胞在波长488 nm蓝色激发光下发出明亮的绿色荧光,其中对照组某些细胞质内出现绿色荧光物质积聚,而转染pSYNi-1干扰组细胞质内绿色荧光物质分布均匀;免疫荧光细胞化学检测结果显示,转染48h后对照组可见α-synuclein免疫阳性产物在胞浆内聚集,转入RNA干扰载体psYNi-1后胞浆内α-synuclein免疫阳性产物分布均匀;HE结果显示,转染48h后,对照组某些细胞质内出现圆形的嗜酸性小体(类Lewy小体)形成;转入RNA干扰载体pSYNi-1后胞浆内未见类Lewy小体形成.结论 RNA干扰技术通过抑制α-synuclein基因的表达,成功阻断了野生型α-synuclein过表达所诱导的α-synuelein蛋白病理性积聚,为终应用RNA干扰技术临床治疗帕金森病提供了某些依据.
关键词： RNA干扰 α-synuclein基因 蛋白积聚 帕金森病 -
α-synuclein基因过度表达诱导HEK293细胞α-synuclein蛋白病理性积聚
目的观察α-synuclein过度表达诱导HEK293细胞α-synuclein蛋白病理性积聚的作用. 方法将消除终止密码子α-synuclein基因扩增产物连入pGEM T-easy载体,DNA测序证实后亚克隆入增强型绿色荧光蛋白pEGFP-N1质粒,通过限制性内切酶酶切鉴定重组质粒.采用脂质2000将野生型α-synuclein-EGFP真核表达载体转染HEK293细胞,48 h后采用Axiovert200型倒置荧光显微镜、荧光免疫细胞化学观察其在细胞内的表达,HE染色观察细胞胞浆内嗜酸性小体的形成. 结果消除终止密码子的扩增序列经测序证实并亚克隆入pEGFP-N1质粒后,限制性内切酶酶切鉴定质粒大小、酶切位点上均符合实验设计.将野生型α-synuclein-EGFP真核表达载体转染HEK293细胞,48 h后荧光显微镜下观察细胞在波长488nm蓝色激发光下发出明亮的绿色荧光,其中某些细胞出现绿色荧光物质积聚;免疫荧光细胞化学检测, EGFP阳性细胞同时也表现为a-synuclein免疫反应阳性,某些细胞胞浆内可见α-synuclein免疫阳性产物聚集;HE结果发现一些细胞胞浆内出现圆形的嗜酸性小体形成,约占细胞总数的10.8%.结论野生型α-synuclein基因过表达可诱导α-synuclein蛋白在HEK293细胞内积聚,胞浆内嗜酸性小体形成.
关键词： α-synuclein基因 蛋白积聚 帕金森病
