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茎环法与加PolyA尾法PCR在检测MicroRNA时引物设计的策略
MicroRNA (miRNA)是一种长约18 ～ 25个核苷酸的非编码RNA,对基因的表达调控发挥着重要的作用.对于miRNA的实时定量PCR与以往的PCR有些不同,这主要是因为miRNA的自身结构比较特殊.其大的特点就是长度过于短小,仅仅二十几个碱基的核酸片段无法直接应用常规的PCR技术扩增.所以,在针对miRNA的PCR技术中,必须要延长待测miRNA的长度,构建出一个足够长的PCR模板,才能进一步应用PCR技术来定量分析.本文介绍的2种方法,茎环法和加尾法,在原理上有所差异.茎环法的原理是,设计一种特殊的茎环结构的反转录引物,在反转录反应中直接完成模板链的延长;而加尾法的思路则是先对miRNA进行加PolyA尾处理,改造成mRNA的结构,再采用mRNA常用的oligo (dT)反转录引物进行反转录,从而得到较长的模板链.
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茎环法通用探针定量检测成熟型微RNA方法的建立
目的 建立通用型荧光探针用于不同成熟型微RNA的定量检测.方法 基于茎环法发明者发明且目前应用为广泛的茎环框架,采用Primer Premier 5.0软件在其茎环框架内部设计了一通用的荧光探针及不同的引物对.采用以上探针和引物对对hsa-miR-143-3p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR-124-3p,hsa-miR-339-5p,hsa-miR-361-5p,hsa-miR-423-3p和hsa-miR-486-5p进行定量检测.结果 结果表明该通用型荧光探针可用于不同成熟型微RNA(hsa-miR-143-3p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR-124-3p,hsa-miR-339-5p,hsa-miR-361-5p,hsa-miR-423-3p,hsa-miR-486-5p)的定量检测.结论该通用型探针可用于茎环法定量检微RNA,可让定量更加准确、实验成本更低.理论上该探针可以用于所有的成熟型微RNA进行荧光定量PCR检测.
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茎环法对转ZmC1基因丹参毛状根中microRNA表达分析
目的:对转ZmC1基因丹参毛状根C1-3株系中8个microRNAs(miRNAs),即miR164b、miR166a、miR166b、miR171a、miR171b、miR172、miR394和miR397进行表达定量分析.方法:以野生型丹参毛状根为对照,采用茎环法(Stem-loop),针对每个miRNA设计3条引物,包括一条特异性反转录引物、一条上游引物和一条通用反向引物.每个miRNA单独反转录,实时荧光定量PCR(qPCR)检测转基因丹参毛状根C1-3中8个miRNA的表达,实验数据用△△Ct法进行分析.结果:与野生型丹参毛状根相比,在转基因毛状根C1-3中8个miRNA均表现为不同程度的上调,其中miR394、miR397和miR164为显著,分别为对照的15.14倍、7.31倍和4.82倍.结论:茎环法可以成功应用于检测丹参中miRNA的表达;C1-3中这几个miRNA转录水平上调可能与ZmC1异源表达引起的有效成分含量及形态发育表型变化相关.
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两种实时定量聚合酶链反应方法检测血浆微量微RNA的比较
目的 比较用茎环和多腺苷酸聚合酶(poly A polymerase,PAP)加尾实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测血浆中微量微RNA (microRNA,miRNA)的区别,并评价2种常用内参基因的表达稳定性.方法 分离成年Sprague Dawley大鼠血浆提取miRNA,使用茎环和PAP加尾实时定量PCR法检测血浆中rno-miR-200b-3p和rno-miR-126-3p的表达水平,采用rno-miR-103a-3p和U6作为内参,采用2△Ct法计算比较两种实时定量方法和内参的选择.结果 茎环法相较于PAP加尾法检测Ct值可以降低2～4个循环数,检测灵敏度增加了10倍;PAP加尾法溶解曲线在明显单峰之前可见小峰,茎环法显示独立单峰,茎环法特异性更优;U6作为内参相对于rno-miR-103a更稳定.结论 对于miRNA浓度偏低的少量样本检测,茎环法有准确、灵敏、特异的优点;对于miRNA含量丰富、大规模组织样本的检测,PAP加尾法则更适用.对于内参基因的选择,使用U6进行miRNA半定量相对于rno-miR-103a-3p更稳定,重复性更强.
关键词： 微RNA 茎环法 多腺苷酸聚合酶法 实时定量聚合酶链反应 血浆
