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含血管内皮生长因子启动子驱动CD自杀基因重组腺病毒的制备及其体外杀伤作用观察

陈建发;黄宗海;俞金龙;厉周;车小燕

摘要: 目的应用AdEasier-1系统高效制备含血管内皮生长因子(VEGF)启动子驱动CD自杀基因重组腺病毒并观察其体外肿瘤杀伤作用.方法以JM109细菌基因组为模板,PCR扩增出含HindⅢ/BamH Ⅰ酶切位点的CD基因,亚克隆到pREP8,继而用HindⅢ/XbaⅠ切出含pA加尾信号的CD基因,插入到预先构建的含VEGF启动子的转移质粒pAdtrack-VEGFP构建pAdtrack-VEGFP-CD.经Pme Ⅰ线性化后转化AdEasier-1细菌,用25 μg/ml卡那霉素筛选阳性克隆,先后进行琼脂糖电泳和Pac Ⅰ酶切鉴定,筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-CD.经293细胞包装、扩增获得重组腺病毒Ad-VEGFP-CD,行PCR鉴定.通过测定细胞克隆形成率和细胞存活率观察重组腺病毒对体外培养的LoVo细胞的细胞毒作用.结果构建重组腺病毒质粒的成功率为70%(7/10).包装扩增后重组腺病毒的滴度为4.8×1012CFU/ml,PCR扩增结果与预期相符.在前药5-氟胞嘧啶存在下,重组腺病毒对LoVo具有明显杀伤作用,细胞克隆形成率和细胞存活率都明显下降.结论应用AdEasier-l系统可以成功制备含VEGF启动子驱动CD自杀基因的重组腺病毒,该重组体具有明显的肿瘤杀伤作用.

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  • 沉默YAP1可抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力

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  • 肿瘤相关巨噬细胞通过诱导肝癌细胞自噬降低索拉菲尼的促凋亡作用

    作者:魏芳;宗世烨;周静;樊敏;王颖;程秀;刘浩

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  • HPLC-MS/MS同时检测大鼠血浆中阿托伐他汀和伏立康唑的浓度

    作者:吕斌;寻添荣;吴树龙;占霞;荣艳;张庆;杨西晓

    目的 建立并应用同时测定大鼠血浆中阿托伐他汀和伏立康唑浓度的液相质谱联用方法(HPLC-MS/MS),研究阿托伐他汀单独给药及与伏立康唑联合给药后,大鼠体内阿托伐他汀的药动学变化以及伏立康唑的浓度变化.方法 采用醋酸钠酸化,甲基叔丁基醚液-液萃取法处理血浆样品,经Thermo Hypersil Gold C18(2.1×100 mm,1.9μm)色谱柱分离,流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液,梯度洗脱,分析时间6 min;质谱检测采用加热电喷雾离子源(H-ESI)正离子扫描方式,选择反应监测(SRM)模式检测,选用m/z559.2→440.2(阿托伐他汀)、m/z350.2→281(伏立康唑)、m/z370.2→252(内标兰索拉唑)作为定量分析的离子.结果 阿托伐他汀在0.01~100 ng/mL(r=0.9957),伏立康唑在0.025~100 ng/mL(r=0.9966)范围内线性关系良好,阿托伐他汀和伏立康唑的日间和日内精密度均小于13%,提取回收率66.50%~82.67%,血浆样品稳定性符合测定要求.单独给药和联合给药后大鼠血浆中阿托伐他汀的AUC0-24 h分别为(438.78±139.61)和(927.43±204.12))h·μg·L-1,CLz/F分别为(23.89±8.14)和(10.43±2.58)L·h-1·kg-1,Cmax分别为(149.62±131.10)和(159.37±36.83)μg·L-1,t1/2分别为(5.08±1.63)和(5.58±2.11)h,Tmax分别为(0.37±0.14)和(3.60±1.52)h,其中AUC0-24 h和CLz/F,Tmax具有显著性差异(P<0.05).同时可测定合并给药组中伏立康唑的血药浓度.结论 本方法简单快速,灵敏度高,可用于同时检测大鼠血浆中阿托伐他汀和伏立康唑的浓度.伏立康唑和阿托伐他汀联用,使阿托伐他汀的部分药代动力学参数发生了改变.

  • 地尔硫卓上调异黏蛋白在肝癌细胞中的表达

    作者:郭睿;金雪媛;田怡;黄小钟;李宗芳;杨军

    目的 研究钙离子通道抑制剂逆转肝癌细胞多药耐药和对异黏蛋白表达的影响及分子机制.方法 采用不同浓度钙离子抑制剂(0、25、50、100、200、400μmol/L)干预肝癌MHCC97H、7402细胞不同时间(12、24、48 h)后,用体外细胞划痕实验检测处理后肝癌细胞运动迁徙能力;采用RT-PCR和免疫细胞化学技术检测钙离子抑制剂对肝癌细胞中P-gp和异黏蛋白的表达的影响.结果 钙离子抑制剂能够一过性抑制肝癌MHCC97H、7402细胞的迁徙运动能力,且具有一定的时间和浓度依赖性特点(P<0.05).同时,不同浓度钙离子抑制剂盐酸地尔硫卓均能一过性上调肝癌MHCC97H、7402细胞中异黏蛋白mRNA和蛋白的表达(P<0.05),但并不抑制P-gp蛋白的表达.结论 钙离子抑制剂地尔硫卓能一过性抑制MHCC97H、7402肝癌细胞的迁徙运动,并能反馈性上调促癌基因异黏蛋白mRNA和蛋白的表达水平.因而,采用钙离子抑制剂很可能具有增加肿瘤进展的潜在风险.

  • 中国城镇居民亚健康评定量表的常模构建

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  • 巴西苏木素对舌癌Tca8113细胞凋亡和自噬的影响及分子机制

    作者:贾亚萌;佟晓哲;范敬炎

    目的 探讨巴西苏木素对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖、凋亡和自噬的影响及其分子机制,为临床用药提供理论依据.方法 用MTT法检测巴西苏木素对Tca8113细胞的增殖作用;Hoechst33342染色法观察细胞形态变化;Annexin V/PI双染色检测巴西苏木素对Tca8113细胞凋亡程度的影响;Western blot法检测凋亡相关蛋白bax、bcl-2、cleaved caspase3及自噬相关蛋白p-AMPK、p-mTOR、LC3B、p62的表达;使用AMPK通路抑制剂与巴西苏木素共同作用于Tca8113细胞,并检测通路相关蛋白p-AMPK、p-mTOR、LC3B的表达.结果 MTT结果表明,巴西苏木素能明显抑制Tca8113细胞的增殖,24 h时IC50为31.17μmol/L;Hoechst33342染色结果显示,巴西苏木素能使Tca8113细胞发生凋亡形态学改变,且与浓度正相关;Annexin V/PI染色结果显示,不同浓度巴西苏木素作用24 h后,细胞凋亡数和凋亡率均高于空白对照组;Western blot检测相关蛋白表达结果表明,巴西苏木素可抑制抗凋亡蛋白bcl-2,促进凋亡关键蛋白bax和cleaved-caspase3的表达,同时增加LC3B和p-AMPK的表达,降低p62和p-mTOR表达.在与抑制剂合用后,p-AMPK与LC3B表达量虽仍略高于空白对照组,但与单纯使用巴西苏木素相比均明显降低,而p-mTOR的表达较巴西苏木素组则明显升高(P<0.05).结论 巴西苏木素能抑制Tca8113细胞增殖并促进其凋亡,同时可通过AMPK/mTOR通路诱导细胞发生自噬.

  • 长片段非编码RNA XIST可改变人鼻咽癌HNE1细胞对顺铂的耐药性

    作者:王浩;李维;谭国林

    目的 明确长片段非编码RNA(lncRNA)X失活特异性转录本(XIST)对人鼻咽癌细胞顺铂(DDP)耐药性的影响及可能的机制.方法 通过荧光定量PCR检测人鼻咽癌顺铂耐药HNE1细胞株(HNE1/DDP)中XIST的表达特征.采用MTT试验观察XIST上调和下调对HNE1/DDP细胞DDP耐药性的影响,并通过EdU试验和流式细胞技术观察其对HNE1/DDP细胞增殖和凋亡的影响.采用蛋白质印迹法检测XIST上调和下调对促凋亡因子程序性细胞死亡4(PDCD4)和Fas配体(Fas-L)蛋白表达的影响.结果 XIST在HNE1/DDP细胞的表达量显著高于HNE1细胞(0.57±0.06 vs 0.1±0.02,P<0.05).下调XIST的表达显著降低HNE1/DDP细胞对DDP的耐药性(P<0.05),而上调XIST增加对DDP的耐药性(P<0.05).下调XIST的表达显著降低HNE1/DDP细胞增殖(6.17±1.93 vs 16.594.86,P<0.05)并诱导细胞凋亡[(18.04±4.72)%vs(4.22±1.65)%,P<0.05],而上调XIST增加细胞增殖(25.40±7.21 vs 13.16±3.95,P<0.05)并抑制细胞凋亡[(2.82±0.88)%vs(6.46±1.75)%,P<0.05].下调XIST的表达显著增加HNE1/DDP细胞中PDCD4(4.10±0.42 vs 1.0±0.12,P<0.05和Fas-L(3.070.29 vs 1.0±0.14,P<0.05)蛋白的表达,而上调XIST降低PDCD4(0.36±0.11 vs 1.0±0.18,P<0.05)和Fas-L(0.17±0.09 vs 1.0±0.21,P<0.05)蛋白的表达.结论 XIST在HNE1/DDP细胞中表达升高,下调和上调XIST的表达可分别降低和增加HNE1/DDP细胞对DDP的耐药性,其机制可能与PDCD4和Fas-L蛋白表达改变相关.

  • 利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞株

    作者:周燕霞;胡韦维;张虹洋;邹琳;张鹏辉

    目的 利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T细胞,为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型.方法 针对G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点靶向设计4对向导RNA(sgRNA),构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒,将其转染至HEK293T细胞内,通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的细胞进行培养,利用T7核酸内切酶1(T7E1)酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率,有限稀释法筛选单克隆细胞,测序鉴定并检测G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变.结果 成功构建基于G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的Cas9-sgRNA外源PX458质粒,T7E1酶切检测四对sgRNA的编辑效率分别为6.74%、12.36%、12.54%、2.94%.测序鉴定敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的细胞株构建成功,细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低,细胞增殖能力下降,维生素K3诱导细胞死亡增加.结论 本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞模型,为后期研究基因的修复奠定了基础.

  • 沉默RRM1可逆转乳腺癌细胞MCF-7/R对紫杉醇的耐药性

    作者:田楠楠;周磊;杨丹妮;吴焕贤;马韵词;吕琳;吴少瑜

    目的 阐明沉默核苷酸还原酶M1亚基(RRM1)对乳腺癌耐药细胞MCF-7/R逆转耐药的作用.方法 通过高浓度紫杉醇诱导耐药株MCF-7/R;运用Kaplan-Meier Plotter绘制RRM1基因的生存曲线;通过siRNA沉默MCF-7/R细胞中RRM1基因表达,并用Western blot和qRT-PCR方法检测蛋白和基因水平的表达,筛选出高效特异的si-RRM1序列;将该si-RRM1序列转染MCF-7/R细胞,筛选得到能稳定抑制RRM1基因表达的细胞株MCF-7/R/siRNA;四甲基偶氮唑盐(MTT)法和5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色法检测RRM1沉默后MCF-7/R细胞增殖能力的变化;流式细胞术检测细胞周期和凋亡,并观察周期、凋亡相关蛋白的变化;构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察沉默RRM1后给予紫杉醇治疗对裸鼠体内抑瘤效果的影响.结果 生存曲线分析显示RRM1基因表达与乳腺癌患者的生存率呈负相关(P=0.000);MCF-7/R细胞中证实RRM1蛋白和mRNA表达水平较MCF-7细胞均显著升高(P<0.01);si-RRM1序列筛选中,转染si-RRM1-04组细胞的RRM1蛋白和mRNA表达量降低为显著(P<0.001);沉默RRM1后,MCF-7/R细胞对紫杉醇的敏感性显著增加,细胞晚期凋亡比例明显升高(P<0.001),同时降低Akt蛋白的磷酸化并抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进p53蛋白表达水平的增加(P<0.001);裸鼠实验显示,与si-NC组相比,沉默RRM1后给予紫杉醇治疗可显著抑制裸鼠体内肿瘤的生长(P<0.001).结论 沉默RRM1可通过诱导细胞凋亡增加提高MCF-7/R细胞化疗敏感性,逆转乳腺癌紫杉醇化疗耐药.

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