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hBcl-2基因修饰的骨髓基质细胞对体外培养PC12细胞的保护作用
目的 观察hBcl-2转染的骨髓基质细胞(MSCs)对体外培养PC12细胞的保护作用,为下一步hBcl-2修饰的MSCs脑内移植治疗奠定基础.方法 采用密度梯度离心结合贴壁法分离、培养大鼠MSCs,对培养第3代的MSCs进行鉴定;hBcl-2用脂质体转染MSCs建立MSCs-hBcl-2基因工程细胞;用H2O2建立PC12细胞氧化应激损伤模型;MTT法检测MSCs-hBcl-2基因工程细胞上清对体外培养的PC12细胞活性的影响.结果 成功培养出MSCs细胞,免疫组化结果显示培养的细胞CD44、CD71表达阳性,而CD45表达阴性;建立了有稳定高效hBcl-2表达的MSCs-hBcl-2基因工程细胞,并观察到MSCs-hBcl-2基因工程细胞较MSCs更能减轻PC12细胞的氧化损伤(P<0.05).结论 hBcl-2基因修饰的MSCs对PC12细胞的生长、生存有着重要的保护作用.
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人Bcl-2蛋白的基因克隆、表达及初步活性分析
目的:以特定形式对高度疏水性的人Bcl-2(hBcl-2)蛋白进行可溶性表达,获得非疏水性hBcl-2蛋白并具备生物学结合活性,为进一步研究hBcl-2三维结构并在此基础上研发特异性小分子药物提供充足的蛋白样品.方法:用PCR方法对hBcl-2基因进行克隆重组,插入原核表达载体pET28a(+)中.用Western Blot和MALDI-TOF生物质谱鉴定,采用荧光极化方法进行活性测定.结果:重组hBcl-2在E.Coli中实现了高效、可溶性的融合表达,重组蛋白经纯化至电泳纯,具备了与Bcl-2家族Bak蛋白BH3功能域特异结合的能力,表明原核表达的重组hBcl-2具有较好的结合活性.结论:成功地对重组hBcl-2蛋白进行了可溶性表达和活性测定.
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hBcl-2基因转染对大鼠肝移植缺血再灌注损伤的保护作用
目的 研究hBcl-2基因转染对大鼠肝脏抗缺血再灌注损伤的效应,并探讨其减轻移植肝缺血再灌注损伤的可行性.方法 (1)同源重组法构建复制缺陷型重组腺病毒Adv-EGFP,Adv-Bcl-2,转染293细胞并包装成腺病毒颗粒后大量扩增和纯化.同法构建空载体病毒质粒;(2)雄性SD大鼠,随机分为Adv-Bcl-2转染组、Adv-EGFP转染组、缺血再灌注组、假手术对照组,以两袖套法建立同种异体肝移植模型.转染组经门静脉灌注转染重组腺病毒Adv-Bcl2-或Adv-EGFP;缺血再灌注组、假手术对照组不予任何处理.实时定量PCR和Western blotting检测各组肝组织bcl-2mRNA和蛋白表达变化;门静脉血流恢复后第0,60及180 min三个时间点测定受体血清AST,LDH,MDA含量.组织切片检测肝细胞形态改变.结果 Adv-Bcl-2转染组bcl-2 mRNA和蛋白表达水平较Adv-EGFP转染组和对照组明显增高(P<0.01) ;Adv-Bcl-2转染组中血清AST,LDH含量明显低于Adv-EGFP转染组和缺血再灌注组.Adv-Bcl-2组血清MDA水平明显低于缺血再灌注组和Adv-EGFP组(P<0.01).与假手术组比较,Adv-Bcl-2处理组HE染色见少量肝细胞水肿和空泡变性,未见片状或点状坏死等.缺血再灌注组和Adv-EGFP组HE染色镜下观察可见小叶结构破坏、肝细胞弥漫不同程度水样变性、体积明显增大、细胞间边界模糊,还可见大量细胞出现脂肪变性及少量碎片状坏死.结论 Adv-Bcl-2转染能通过诱导bcl-2基因表达减轻移植肝缺血再灌注损伤.
