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哇巴因对人血管内皮细胞死亡和钠泵α1、β1,亚单位表达的影响
目的:研究钠泵抑制剂哇巴因(ouabain)对人血管内皮细胞死亡的影响及其作用机制.方法:以脐静脉内皮细胞系ECV304为靶细胞,应用MTT实验检测哇巴因对细胞生长的作用;采用Hoechst33342/PI双荧光染色、透射电镜和DNA琼脂糖凝胶电泳等分析细胞死亡特征,半定量RT-PCR法检测钠泵α1和β1亚单位mRNA的表达.结果:哇巴因以浓度和作用时间依赖的方式抑制ECV304细胞生长.10μmol/L哇巴因作用24 h,引起细胞坏死;0.1μmol/L哇巴因作用24～48 h,细胞明显脱落,细胞间连接丧失,细胞出现染色质凝集、分布于核膜内缘、DNA裂解等凋亡特征.哇巴因能明显上调ECV304细胞钠泵α1亚单位mRNA的表达,下调β1亚单位mRNA表达,且两者均呈时间依赖性.结论:哇巴因能诱导人血管内皮细胞ECV304死亡,其上调钠泵α1亚单位表达、下调β1亚单位表达,可能与亚单位介导信号传递、降低细胞黏附有关.
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从噬菌体7肽库中筛选的哇巴因结合肽对血管内皮细胞的保护作用
目的:寻找与哇巴因高亲和力结合并抑制其生物功能的相关小分子肽,为治疗原发性高血压提供新策略.方法:以哇巴因为筛选分子,应用M13噬菌体呈现随机7肽库进行筛选.经过3轮生物淘筛,并通过ELISA法鉴定,对噬菌体阳性克隆ssDNA电泳鉴定和基因测序分析.委托合成筛选获得哇巴因结合肽,采用放射配基受体结合法检测其结合活性;MTT法检测血管内皮细胞的增殖抑制率,Hoechst33342/PI双荧光染色检测细胞形态学变化;利用RT-PCR和细胞免疫荧光检测钠泵α1、β1的表达水平;荧光探针检测细胞内游离Na+浓度变化.结果:筛选获得14个阳性克隆,基因测序显示:哇巴因结合肽一致率达64.3%(9/14).委托合成肽(Arg-Cys-Met-Thr-Ser-Arg-Ser).放射性配基受体结合法检测显示,合成的哇巴因结合肽能够与哇巴因结合.哇巴因结合肽+哇巴因的EAhy926细胞组增殖抑制率小于哇巴因组(P<0.05);Hoechst33342/PI双荧光染色显示细胞死亡数量减少;RT-PCR和免疫细胞化学检测钠泵α1、β1亚单位转录和翻译水平,显示哇巴因结合肽能拈抗哇巴因所引起钠泵α1亚单位表达的上调、β1亚单位的下调作用;荧光探针显示哇巴因结合肽能够拮抗哇巴因对钠泵的抑制作用.结论:哇巴因特异性结合肽能够阻抑哇巴因对血管内皮细胞的抑制增殖和诱导死亡作用,为研究哇巴因与钠泵的相互作用机制及进一步研究抗哇巴因的分子药物奠定基础.
