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小鼠肝炎病毒N蛋白间接ELISA方法的建立
目的 运用重组蛋白作为包被抗原建立检测小鼠肝炎病毒抗体的间接ELISA方法.方法 将大肠杆菌表达小鼠肝炎病毒核衣壳蛋白(Nucleocapsid N)的主要抗原域NP(S)纯化后作为诊断抗原,通过条件优化,建立检测小鼠肝炎病毒抗体的间接ELISA方法.结果 确定其包被抗原的浓度为300 ng/mL,血清稀释度为1:200,山羊抗小鼠酶标抗体的稀释浓度为1:3000.S/P≥0.386则为阳性,S/P<0.308为阴性,两者之间为可疑.经阻断试验、交叉试验和重复性实验,表明该方法特异性强,重复性好.与国家实验动物检测中心的MHV全病毒ELISA抗体诊断试剂盒比较,特异性、敏感性和符合率分别为94.1%、93.3%和93.9%.用该融合蛋白包被聚苯乙烯板后在-20℃下可保存5个月,应用该方法检测了98份送检的血清样品,有10份检测为阳性.结论 本研究建立的间接ELISA特异性强,重复性好,为进一步开发MHV血清抗体诊断试剂盒奠定了基础.
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检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的重组N蛋白-ELISA的建立
将已构建成菌的重组质料Petn转化入E.coli BL21(DE3)中,在佳诱导条件下获得重组N蛋白.随后用His-Bind对表达产物进行纯化,对纯化效果及纯化产物的特异性分别用SDS-PAGE电泳及Western-blot试验检测.在此基础上,以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,对各种条件进行优化(如抗原的包补,作用时间及底物的选择),确定了判定标准,建立了检测PRRS抗体的间接ELISA方法.用此方法检测了200份血清样品,并与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果相比较,符合率达91%.
关键词： 重组质料 重组N蛋白 猪繁殖与呼吸综合征抗体 间接ELISA -
检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的重组N蛋白一乳胶凝集试验的建立
猪繁殖与呼吸综合征(Poreine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)于1987年首先在美国被发现,现在已经成为危害世界养猪业发展的重要传染病之一.我国已在许多地区分离到该病的病原体-猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome viruS,PRRSV),从而证实了该病在我国的流行[1～4].这些年来,本病的临诊表现及流行病学也出现了新的变化,如隐性感染及慢性感染病例显著上升,持续性感染在猪群中较为普遍.由于本病同其它引起猪繁殖障碍的疾病(如猪细小病毒病、伪狂犬病等)表现出极为相似的临床症状,并伴随混合感染和继发感染[5]增加了临床诊断的难度.所以,探索一种简便易行具有推广意义的检测方法成为本研究的方向.
关键词： 重组N蛋白 猪繁殖与呼吸综合征抗体 血清抗体 乳胶凝集试验 -
SARS-CoV E、M和N蛋白克隆、表达及抗原性的研究
目的 获得大量SARS-CoV E、M和N重组蛋白,研究其抗原性.方法 应用基因工程技术构建pGEX4T-1/SARS-CoV E、M和N大肠杆茵工程茵,表达、纯化重组蛋白,通过Western blot分析其免疫反应性.结果 通过PCR扩增获得SARS-CoV E、M、N片断;以原核表达质粒pGEX4T-1为载体,构建了原核表达重组质粒pGEX4T-1/E、pGEX4T-1/M和pGEX4T-1/N.重组N蛋白在大肠杆菌系统中以可溶性形式大量表达,分子量约为71.97 kDa.Western blot分析证实,重组N蛋白可与pVAX1-N基因疫苗免疫的小鼠血清产生免疫反应.重组E蛋白和重组M蛋白表达量极低,分子量约为35kDa和46kDa. 结论成功地构建了SARS-CoV N大肠杆菌基因工程菌,能以可溶性形式高水平地表达重组N蛋白;该蛋白具有较好的免疫反应性和抗原特异性,可能成为SARS血清学诊断的候选抗原之一.
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小鼠肝炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
[目的]制备并鉴定小鼠肝炎病毒(MHV)N蛋白的单克隆抗体(mAb).[方法]以Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达的重组N蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,应用常规杂交瘤技术将免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤进行融合,用间接ELISA方法筛选分泌N蛋白mAb的杂交瘤细胞系.并用Western blot和IFA方法对所获得的mAb进行鉴定.[结果]共获得4株稳定分泌抗N蛋白mAb的杂交瘤细胞系,其亚类鉴定2株为IgG2a,1株为IgG2b,1株为IgG1,轻链均为k型.经鉴定4株mAb均能与重组N蛋白发生特异性反应.[结论]成功获得了特异性抗MHV N蛋白的mAb,为进一步研究N蛋白的结构功能及建立诊断学方法奠定了基础.
