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奎尼酸脱氢酶文献资料
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大肠杆菌aroE基因的克隆与表达
目的: 克隆表达大肠杆菌莽草酸脱氢酶基因aroE,并测定其生物学活性.方法: 根据大肠杆菌中aroE基因的序列设计了一对引物,利用PCR 技术扩增得到aroE基因,将其克隆入高效原核表达载体pBV220,以双脱氧法进行测序,然后对该重组子利用温度诱导表达,并测酶的生物活性.结果: 构建了aroE基因的克隆和表达重组子, aroE基因获得高效表达,SDS-PAGE 图谱显示新增30×103 蛋白带,酶活性测定结果表明奎尼酸脱氢酶的相对酶活性是5.6倍.结论: 实现了莽草酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的高效表达,证明了其具有奎尼酸脱氢酶活性,为构建产奎尼酸工程菌种奠定了基础.
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脱氢奎尼酸合成酶和奎尼酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的共表达
目的:构建共表达载体pETDuet-aroB-qutB,在大肠杆菌中同时表达奎尼酸合成途径中的关键酶脱氢奎尼酸合成酶(DHQase)和奎尼酸脱氢酶(QDHase).方法:分别以大肠杆菌(B21)和构巢曲霉(ATCC 24919)基因组为模板,采用PCR法扩增得到脱氢奎尼酸合成酶基因aroB和奎尼酸脱氢酶基因qutB,克隆接入pETDuet-1载体中,转化入大肠杆菌BL21,在宿主菌中共表达脱氢奎尼酸合成酶和奎尼酸脱氢酶.结果:获得了包含pETDuet-aroB-qutB共表达载体的重组大肠杆菌.IPTG(0.5 mmol/L)诱导重组菌4 h后,脱氢奎尼酸合成酶和奎尼酸脱氢酶表达量分别占菌体总蛋白的18.7%和30.5%,酶活力为70.4 U/L、40.2 U/L,分别提高了14.1倍和22.3倍.结论:实现了脱氢奎尼酸合成酶和奎尼酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的高效共表达,为基因工程法生物合成奎尼酸奠定了基础.
