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骨髓间充质干细胞的培养和超顺磁氧化铁标记
目的 探讨全血贴壁法培养成年大鼠骨髓间充质干细胞的可行性,寻找一种对间充质干细胞进行示踪的方法.方法 取6～8周龄雄性SD大鼠胫骨、股骨,收集骨髓腔冲洗悬液直接培养,经多次换液、传代,免疫组化法检测CD34、CD44表达情况.以超顺磁氧化铁和P3代间充质于细胞共同孵育培养24 h,普鲁士蓝染色评价标记效率,台盼蓝染色检验标记后细胞的活性.结果 全血贴壁法培养的大鼠间充质干细胞贴壁,呈纤维细胞样生长,CD44阳性细胞比率为96%,不表达CD34.经超顺磁氧化铁标记后,普鲁士蓝染色标记效率为90%,标记后98%的细胞保持活性.结论 全血贴壁法能成功培养大鼠间充质干细胞,超顺磁氧化铁可以安全、有效地标记间充质干细胞.
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不同神经示踪剂组合对大鼠脊髓运动神经元的逆行标记效率比较
目的:探讨神经示踪剂荧光金(FG)、真蓝(TB)和荧光红(FR)两两组合对脊髓运动神经元的标记效率差异,为再生神经重支配准确性研究奠定基础.方法；采用大鼠胫神经示踪模型,采取神经内注射与神经横断后近侧断端浸泡(20 min)2种方式,分别对FG、TB和FR的两两组合进行示踪试验.示踪术后5d,取脊髓腰膨大段冷冻纵切,共聚焦显微镜进行显微成像和计数.结果:FG联合TB示踪标记的运动神经元数量多,其次为FG联合FR,而FR联合TB组标记细胞数少,双标比例也小.神经断端浸泡方式使用示踪剂时标记效率仅为神经内注射的2/3左右.结论:FG联合TB以及FG联合FR示踪对脊髓运动神经元的标记效果较好,且神经内注射使用示踪剂效果优于持续20 min的神经断端浸泡.
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小鼠骨髓来源巨噬细胞的SILAC代谢标记及生物质谱分析
目的 作为模型细胞之一,小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)是药理学、药效学研究的重要工具和对象.然而,由于巨噬细胞增殖能力较弱,代谢标记细胞内蛋白一直是巨噬细胞生物学中的一个难题.因此,本研究以SILAC(stable isotope labeling with amino acids in cell culture)方法标记BMM.方法 小鼠骨髓细胞的分离,以M-CSF诱导6 d并制备BMM,同时,SILAC标记细胞内蛋白;进而,裂解细胞并收集蛋白质,以SDS-PAGE进行初步分离,经胶内酶解成肽段,再通过质谱分析测定,统计得其标记效率.结果 小鼠骨髓细胞在分化6 d时点成熟BMM可占细胞总数的0.965.以70 ku条带为研究对象,d 6、8和d 10鉴定到重链赖氨酸标记蛋白数分别为18、12和13个.其中,有8个蛋白在该3个时点中均被检出.统计结果表明3个时点的重链赖氨酸蛋白标记效率分别为(90.62±0.03)%、(90.23±0.03)%和(90.40±0.02)%,达到了SILAC研究的要求.结论 该方法解决了BMM的SILAC标记问题,可为以巨噬细胞为研究对象的药理学研究提供有效的研究手段.
