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CRISPR/Cas9系统在腺样囊性癌细胞中编辑纤连蛋白基因EDA片段的研究
目的 利用成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(associated proteins,Cas)编辑纤连蛋白(fibronectin)基因抑制其可变剪接片段基因外显子A(extra domain A,EDA),并观察对腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)的促肿瘤作用.方法 根据纤连蛋白序列设计两段互补于EDA上游和一段与下游互补的引导RNA (single guide RNA,sgRNA,20 bp),分别连接至PX330质粒的U6启动子下游.质粒转染至ACC细胞系SACC-83,PCR扩增基因组并测序验证其定点敲除EDA结果及效率.质粒转染后的细胞进行稳定株的筛选及鉴定,将筛选后的稳定株作为EDA敲除实验组,SACC-83细胞为对照组,进行CCK-8细胞增殖和Transwell侵袭能力检测,每组实验重复3次.结果 sgRNA连接至PX330质粒U6启动子下游,成功构建了质粒敲除模型;SACC-83的基因组EDA外显子被敲除,敲除效率达70％以上,但纤连蛋白总量未发生明显变化.筛选出3株EDA敲除稳定株(A+C-2、A+C-6、B+C-10),并通过PCR鉴定证实其可靠性.划痕实验中实验组细胞运动速率[A+C-2 (21.67±1.87) μm/h;A+C-6(12.22±2.13) μm/h;B+C-10(20.00±2.56) μm/h]相对对照组[(27.78±3.20) μm/h]降低;增殖实验显示EDA敲除组细胞倍增时间增加[对照组SACC-83 (38.52±4.26)h,实验组A+C-2(62.05±5.80)h,A+C-6(46.32±6.35)h,B+C-10(40.7±3.88)h].结论 在sgRNA的引导下,CRISPR/Cas系统能简洁、高效地敲除细胞基因组中的EDA可变剪接外显子,EDA敲除对肿瘤细胞运动和侵袭有明显抑制作用.
