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大鼠口腔黏膜固有层前体细胞与外胚间充质细胞生长特性的研究
目的 比较大鼠口腔黏膜固有层前体细胞(oral mucosal lamina propria progenitor cell,OMLPPC)与面突外胚间充质细胞(ecto-mesenchymal stem cells,EMSC)体外生长特性.方法 免疫磁珠筛选OMLPPC,差速贴壁法分离EMSC.利用免疫组织化学方法对分离细胞进行鉴定.分别利用CCK-8、流式细胞等方法检测其生长增殖能力、细胞周期,并检测细胞克隆形成能力,观察并比较两种细胞的体外增殖特性.结果 体外培养过程中,两者都是梭形类成纤维样细胞,OMLPPCs贴壁、克隆样生长,细胞汇合后,细胞呈短梭形.生长曲线结果显示,OMLPPCs无明显的生长滞缓期,8天后仍保持强的增殖活力.EMSCs具有明显的缓慢生长期、对数生长期及平台期.细胞克隆形成能力比较,EMSCs的克隆形成能力比OMLPPCs强.流式细胞检测结果显示,EMSCs第1代增殖指数为9.78,OMLPPCs为14.97;第2代时EMSCs为40.04,OMLPPCs为30.38.结论 OMLPPC具有与EMSC相似的间充质干细胞形态,EMSCs为更早胚胎组织来源的干细胞,而OMLPPCs细胞组成相对单一.OMLPPCs在体外生长过程中具有较强的增殖适应性,可以作为间充质前体细胞的来源,为相关口腔组织的组织工程构建提供候选种子细胞.
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TGF β1和bFGF对鼠口腔黏膜固有层前体细胞的影响
目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)和碱性成纤维细胞因子(bFGF)对大鼠口腔黏膜固有层前体细胞(OMLPPC)的增殖及碱性磷酸酶活性的影响.方法 体外扩增培养OMLPPC,利用5ng/mL TGF-β1、10ng/mlbFGF单独及联合作用于OMLPPC,利用MTT方法检测OMLPPC的增殖,利用试剂盒检测其碱性磷酸酶活性,以RT-PCR方法检测各组矿化基因骨钙素(OCN)的表达.结果 对细胞的增殖,3d时各组间未见显著性差异;7、14d,bFGF单独作用明显促进细胞的增殖(P＜0.05),TGF-β1单独作用抑制细胞的增殖(P＜0.05).TGF-β1+bFGF组7d时增殖不受影响,14d时增殖变缓.碱性磷酸酶活性检测,对照组及bFGF组各时间点增加均无显著性差异.TGF-β1组间7、14d比3d时ALP活性有显著性差异(P＜0.05).TGF-β1 +bFGF组14d时ALP活性显著增强(P＜0.05).RT-PCR检测OCN结果显示,各组培养14d后,TGF-β1组、TGF-β1+ bFGF组表达OCN,对照组、bFGF组未见表达.结论 一定浓度的bFGF和TGF-β1联合作用,不仅可保证OMLPPCs的增殖,而且能诱导并促进其向矿化方向的分化.
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大鼠口腔黏膜固有层前体细胞复合不同支架材料的实验研究
目的 探讨口腔黏膜固有层前体细胞(oral mucosal lamina propria progenitor cell,OMLPPC)在不同支架材料上的生物学特性.方法 利用免疫磁珠方法筛选OMLPPC,体外培养分成2组:A组正常培养,B组利用矿化诱导条件培养基诱导.2组细胞分别与陶瓷化骨、胶原-壳聚糖支架材料复合,利用扫描电镜、HE等方法,观察细胞在2种支架材料上的生长情况；并分别移植入裸鼠体内,利用HE及Gimsa染色观察OMLPPC复合2种支架材料在体内环境中的生长分化情况.结果 体外环境中,2组细胞在陶瓷化骨、胶原-壳聚糖支架材料上都可复层生长.体内环境中,正常培养细胞+陶瓷化骨组,在体内4周生成基质样物质,8周形成典型的骨样组织；矿化诱导组,只可见陶瓷化骨围绕,有基质样物质沉积,未见明显骨样组织形成；2组细胞与胶原-壳聚糖支架材料复合,体内4、8周在2组细胞间材料空隙内可见生长的细胞和胶原基质样成分.结论 不同支架材料对OMLPPC生物学行为有重要影响.OMLPPC在特定的环境中可形成硬组织,可为组织工程骨组织或牙齿硬组织构建提供种子细胞.
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应用组织工程口腔黏膜固有层修复颊黏膜缺损的实验研究
目的:评价组织工程口腔黏膜固有层修复颊黏膜缺损的效果.方法:以壳多糖-胶原凝胶为网架,与体外培养的Wistar大鼠口腔黏膜成纤维细胞构建壳多糖-胶原凝胶口腔黏膜固有层(FPCCL),用5-BrdU标记其中的成纤维细胞后,移植修复同种异体大鼠口腔颊黏膜圆形缺损(用直径8 mm的圆形刀制成);21只Wistar大鼠随机分为FPCCL组(12只)及对照组(9只).术后行大体观察、创面直径测量、组织学及免疫组织化学观察;所有数据用SPSS11.5统计软件包进行t检验.结果:术后大鼠创面无感染,术后7 d时,2组创面均被浅黄色膜覆盖,术后14、21 d时,2组创面完全被新生黏膜覆盖.术后7 d时,对照组创面比FPCCL组创面显著为小(P＜0.05).组织学观察:术后7 d,2组创面未完全上皮化.术后14、21 d时,2组创面完全上皮化,有钉突;上皮复层,表面有角化物;新生固有层中细胞数量较多,含毛细血管.免疫组织化学染色,FPCCL组术后7、14、21 d时阳性成纤维细胞出现在肉芽组织的细胞密集处和新生固有层中,与新生组织共同参与了颊黏膜缺损的修复重建,未出现免疫排斥现象.结论:FPCCL在修复重建颊黏膜缺损、限制创口收缩方面明显优于对照组,FPCCL作为颊黏膜缺损区永久性固有层替代物是可行和有效的.
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利用Nestin筛选分离培养大鼠口腔黏膜固有层前体细胞
目的:对大鼠口腔黏膜固有层中前体细胞进行分离培养.方法:以nestin为标志物,利用免疫磁珠间接筛选法,对大鼠口腔黏膜固有层前体细胞进行筛选;免疫荧光鉴定,并用MTT法、流式细胞术检测其特性.结果:筛选细胞在体外呈克隆性生长,免疫荧光显示表达nestin、波形丝蛋白,不表达角蛋白;增殖活力旺盛;流式细胞检测结果显示85.02%的细胞处于G0/G1期.结论:成功分离培养出大鼠口腔黏膜固有层的间充质源性前体细胞,可为组织工程组织构建提供种子细胞.
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以胚鼠脱细胞真皮构建口腔黏膜固有层的实验研究
目的:探讨以胚鼠脱细胞真皮构建组织工程化口腔黏膜固有层的可行性.方法:取胚鼠皮肤制备脱细胞真皮支架,将体外培养的人口腔黏膜成纤维细胞复合入胚鼠脱细胞真皮支架中,分别于接种后的1、4、7 d行HE染色、荧光显微镜及电镜检测.结果:胚鼠脱细胞真皮支架行HE染色显示未见细胞残留,表皮-真皮结合面保存波浪状基底膜样结构,HE、荧光显微镜及电镜检测均显示成纤维细胞复合入胚鼠脱细胞真皮支架后可黏附、生长、增殖.结论:以胚鼠脱细胞真皮体外构建的口腔黏膜固有层具有较好的组织构架,为进一步研究成纤维细胞-上皮细胞相互作用机制和构建全层口腔黏膜提供良好的实验模型.
