呼吸道合胞病毒感染导致大鼠肾病病理模型持续感染证据研究

目的探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染 SD 大鼠的肾病病理模型中,RSV 持续感染证据。方法选取2个月龄、体重为180~200 g 的清洁级雄性 SD 大鼠62只为研究对象。采用随机数字表法将其随机分为 RSV 组(n=35)与对照组(n=27)。①对 RSV 组 SD 大鼠,采用毒力疱斑形成单位(PFU)为6×106 RSV 液(0.4 mL/d 腹腔注射+0.2 mL/d 鼻腔滴注)×3 d 处理,建立 RSV 感染SD 大鼠肾病病理模型。对照组采用磷酸盐缓冲液(PBS)(0.4 mL/d 腹腔注射+0.2 mL/d 鼻腔滴注)×3 d 处理,建立对照组 PBS 模型。两组均以造模前1 d 计算为第0天,造模结束时计算为造模成功第1天。通过电子显微镜观察 RSV 感染 SD 大鼠肾病病理模型造模结束后第7与60天的肾小球超微结构改变,判断 SD 大鼠肾病病理模型造模是否成功。②RSV 组 SD 大鼠肾病病理模型造模成功后,将35只 SD 大鼠平均分为7个亚组(RSV 0、7、15、30、60、90及120 d 亚组),每个亚组均为5只SD 大鼠；将对照组27只 PBS 模型 SD 大鼠,按照上述时间点分为7个亚组(PBS 0、7、15、30、60、90及120 d 亚组),每个亚组分别为5、5、5、3、3、3、3只 SD 大鼠。分别测定各个 RSV 亚组与 PBS 亚组 SD大鼠的24 h 尿蛋白定量、血清白蛋白及血清肌酐水平等指标,并进行统计学分析。③于上述指标测定完毕后,分别于上述时间点处死 RSV 亚组与 PBS 亚组 SD 大鼠。同时,切除 SD 大鼠左肾下2/3、左肺下2/3和脾下2/3,以4%多聚甲醛固定24 h 后,石蜡包埋后切片,采用苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察各个亚组 SD 大鼠肾、肺、脾组织是否发生病理学形态结构改变。④以 RSV G 蛋白单克隆抗体为一抗,制作 RSV 组 SD 大鼠肾、肺、脾组织免疫组化检测标本,于光镜下寻找各个 RSV 亚组RSV G 蛋白存在证据。⑤以 RSV G 蛋白单克隆抗体为一抗,采用与绿色荧光试剂结合,同时采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料蓝染细胞核,制作各个 RSV 亚组 SD 大鼠肾组织荧光免疫检测标本,于荧光显微镜下寻找 RSV G 蛋白存在证据及其与细胞核关系。⑥切除剩余 RSV 亚组左肾上1/3,以3%戊二醛固定后,送至四川大学华西医院病理科制作电子显微镜标本,于电子显微镜下观察各个 RSV 亚组 SD 大鼠肾小球超微结构是否发生病理改变,同时寻找 RSV 颗粒。结果①RSV 组SD 大鼠肾病病理模型造模成功,对照组 PBS 模型亦造模成功。②各个 RSV 亚组与 PBS 亚组 SD 大鼠的24 h 尿蛋白定量水平检测结果显示,RSV 0与90 d 亚组分别与相同时间点 PBS 亚组比较,差异均无统计学意义(P >0.05)；而 RSV 7、15、30、60及120 d 亚组,却分别较相同时间点 PBS 亚组均显著升高,并且差异均有统计学意义(t=6.9、3.1、3.9、2.2、5.6,P <0.05)。血清白蛋白及血清肌酐水平检测结果显示,7个 RSV 亚组分别与相同时间点的7个 PBS 亚组比较,差异均无统计学意义(P >0.05)。③于光镜下观察各个 RSV 亚组 SD 大鼠的肾、肺、脾组织形态结构(HE 染色)结果显示,除RSV 0 d 亚组外,其余各个亚组肾、肺、脾组织形态结构均出现不同程度病理改变。④于光镜下观察各个 RSV 亚组 SD 大鼠的肾、肺、脾组织免疫组化技术检测结果显示,除 RSV 0 d 亚组外,其余各个RSV 亚组肾、肺、脾组织中,均有特异性 RSV G 蛋白呈持续阳性表达。各个 RSV 亚组肾小球 RSV G蛋白定量分析结果显示,RSV 0、7、15及30 d 亚组 RSV G 蛋白表达水平呈逐渐增强趋势,并维持在高水平,但在 RSV 60、90及120 d 亚组又呈逐渐减弱趋势。⑤于荧光显微镜下观察各个 RSV 亚组SD 大鼠肾组织 RSV G 蛋白荧光免疫检测结果显示,RSV G 蛋白与 DAPI 蓝染的细胞核重叠。⑥透射电子显微镜下观察发现,RSV 组肾组织中 RSV 颗粒持续存在,RSV 120 d 亚组肾小球超微结构仍存在病理改变。结论 RSVG蛋白在 RSV 感染 SD大鼠肾病病理模型造模成功后,大鼠肾、肺、脾组织中 RSV G 蛋白呈持续阳性表达,证明 RSV 呈持续感染状态。这一结果或提示,包括 RSV 在内的呼吸道病毒持续感染,是导致微小病变型肾病综合征(MCNS)患儿免疫功能紊乱的主要原因。