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嗜麦芽寡养单胞菌临床株多重耐药外排泵SmeDEF调控基因smeT的序列分析
目的了解嗜麦芽寡养单胞菌的临床株中,SmeDEF外排泵表达调控基因smeT与耐药性有关的序列变化.方法对嗜麦芽寡养单胞菌smeD-smeT基因间区和部分smeT序列进行PCR扩增,并对扩增产物进行序列分析;提取的RNA并加聚A尾,对smeT的3'端进行分析.结果选取耐药、敏感的泵抑制阳性株和耐药、敏感的泵抑制阴性嗜麦芽寡养单胞菌7株;发现对氟喹诺酮类耐药的泵抑制阳性菌的smeD-smeT间区测序基因序列与敏感株明显不同;所检测7株菌无论敏感或耐药在SmeT序列的166位氨基酸均为Leu,泵抑制阳性耐药株的SmeT序列在218位氨基酸为Asp/Glu替换.结论嗜麦芽寡养单胞菌临床株在相应于smeT的-165～-82区序列差异,以及SmeT的Asp218Glu氨基酸替换和多个位点的突变可能与多重外排的耐药有关.
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重组分泌型人CREG/myc-His融合糖蛋白的表达及功能分析
目的:构建人E1A激活基因阻遏子(Human cellular repressor of E1A-stimulated gene,hCREG)基因的真核表达载体并转染人293F细胞株,筛选稳定转染细胞克隆,鉴定重组的分泌型hCREG/myc-His融合蛋白的糖基修饰和生物学功能.方法:用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开放读码框并构建pcDNA4 myc-His/hCREG真核表达载体;Lipofectamine 2 000转染人293F细胞株并筛选稳定表达细胞克隆,去血清法诱导重组蛋白表达;应用Western blot方法鉴定分泌型hCREG/myc-His融合蛋白的表达,糖苷酶法及Western blot行hCREG/myc-His融合蛋白的糖基化分析;用流式细胞周期分析分泌型hCREG/myc-His融合蛋白对体外培养的人胸廓内动脉平滑肌细胞(HITASY)增殖能力的影响.结果:RT-PCR扩增含终止密码突变的hCREG cDNA片段,经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切构建了pcDNA4 myc-His/hCREG真核表达载体,酶切及测序结果证实构建的重组质粒正确;Western blot证实转染pcDNA4 myc-His/hCREG的293F细胞克隆可以稳定表达并分泌hCREG/myc-His融合蛋白;糖苷酶分析证实分泌型hCREG/myc-His融合蛋白是糖基化蛋白;流式细胞周期分析证实与正常培养HITASY细胞比较,添加含有分泌型hCREG/myc-His糖蛋白上清的HITASY细胞出现明显的G1期细胞周期阻滞现象(58.88% vs 62.89%,P＜0.005).结论:构建了pcDNA4 myc-His/hCREG真核表达载体并表达了具有生物学功能的分泌型重组hCREG/myc-His糖蛋白.
关键词： 腺病毒E1A蛋白(E1A) 阻遏子 真核表达载体 糖蛋白 -
E1A激活基因阻遏子蛋白与细胞膜受体IGF2R(11～13)结构域作用抑制人血管平滑肌细胞迁移
目的 研究人E1A激活基因阻遏子基因(CREG)蛋白在人血管平滑肌细胞迁移中的作用.方法 构建含有myc和His标签的野生型CREG(wtCREG)和去糖基化突变型CREG(mCREG)真核表达载体pcDNA3.1myc-His/wt/mCREG.转染人293F细胞株,Ni-NTA亲合层析方法纯化获得wtCREG和mCREG蛋白;将重组wtCREG(400 nmol/L)及mCREG蛋白(400 nmol/L),分别加入体外培养的低表达CREG的人血管平滑肌细胞OB2中,应用Western blot、细胞刮伤实验、明胶酶电泳方法观察两种重组人CREG蛋白对人血管平滑肌细胞迁移和分化等生物学行为的影响;通过不同浓度(2、4、8 mg/L)的胰岛素生长因子2受体(M6P/IGF2R)中和抗体与人M6P/IGF2R细胞外结构域蛋白小肽分别进行阻断实验,分析M6P/IGF2R是否参与介导CREG蛋白对平滑肌细胞迁移的调控.结果 刮伤实验发现,加入佳效应浓度的wtCREG和mCREG蛋白24h后,OB2组细胞的迁移能力均明显下降;明胶酶电泳和Western blot检测结果也证实,两种重组CREG蛋白均可以使细胞外基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9的合成及活性减少,而组织金属蛋白酶抑制物表达则明显增加;同时,Western blot分析也证实,平滑肌细胞分化标志蛋白myocardin、SM α-actin、肌球蛋白重链和caldesmin表达增加,LM-1和FN表达减少.提示两种重组CREG蛋白均能够抑制体外培养的人血管平滑肌细胞迁移,促进其分化.IGF2R中和抗体和IGF2R小肽阻断实验证实:不同浓度的Anti-M6P/IGF2R能有效阻断两种CREG蛋白对人血管平滑肌细胞迁移和细胞外基质合成的调控作用.并且,M6P/IGF2R的第11 ～13结构域小肽片段对wt/mCREG蛋白的生物学效应也有明显的阻断作用.结论 重组CREG蛋白可能通过细胞膜表面M6P/IGF2R的11 ～13结构域抑制人血管平滑肌细胞迁移和细胞外基质分泌,维持细胞分化.
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人E1A激活基因阻遏子的表达、抗体制备及生物学活性分析
目的: 构建人E1A激活基因阻遏子(human cellular repressor of E1A-stimulated gene,hCREG)基因的原核表达载体,纯化重组的hCREG融合蛋白并制备兔抗hCREG抗体.探讨hCREG蛋白在人血管平滑肌细胞克隆株(HITASY)中的表达、定位.方法:用PCR技术,扩增hCREG并构建pGEX-4T-1/hCREG原核表达载体.诱导表达重组谷胱甘肽巯基转移酶(glutathioneS-transferase,GST)-hCREG融合蛋白.以GST-hCREG为抗原,制备兔抗人GST-hCREG的抗血清,并通过蛋白A和GST亲和层析纯化.用ELISA和Western blot法检测抗体的效价和特异性;用免疫荧光染色法检查去血清培养前后HITASY细胞中hCREG蛋白的表达及定位;用BrdU染色观察分泌型hCREG蛋白对HITASY细胞增殖的影响.结果:经鉴定证实构建的重组质粒正确.诱导后pGEX-4T-1/hCREG菌株可表达大量的GST-hCREG融合蛋白,层析纯化后其纯度达90%.Western blot检测表明,纯化的兔抗hCREG抗体可与hCREG蛋白特异性结合.ELISA测得该抗体的效价＞1∶105.免疫荧光染色检测显示,去血清培养诱导的HITASY细胞中hCREG蛋白的表达增加且定位在核周围.BrdU染色表明,hCREG可明显抑制HITASY细胞增殖.结论:成功地获得兔抗hCREG抗体.证实去血清培养的血管平滑肌细胞中CREG蛋白的表达上调.表达的hCREG蛋白可抑制HITASY细胞增殖,提示hCREG可能参与调控血管平滑肌细胞的增殖与分化.
