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应用cDNA RDA联合cDNA阵列点杂交筛查差异表达基因的方法学分析
目的探讨采用cDNA代表性差异分析法(representational difference analysis,RDA)联合cDNA阵列点杂交筛查差异表达基因的可行性及局限性.方法将17β雌二醇(E2)干预MG-63细胞cDNA分别制备成检测和驱赶扩增子进行消减杂交作为整个cDNA RDA的内部质控,以干预组扩增子、对照组扩增子和第4轮双向消减产物为模板,行内对照基因GAPDH的RT-PCR进行消减效率分析,Southern杂交证实消减产物来源,快速Northern杂交证实消减产物确实呈差异表达;克隆到pGEM-T easy载体,转化JMl09感受态细菌并铺Amp+/X-gal/IPTG琼脂皿得到差异表达文库,随机挑取白色单菌落培养后点成尼龙阵列膜,分别与干预组和对照组扩增子及第4轮消减产物杂交,得到差异表达克隆用于后续研究.结果内部质控结果显示,第3轮消减杂交后,PCR未见差异性产物扩增;cDNA RDA共得到3个雌二醇诱导表达上调条带和2个表达下调条带.Southern杂交结果显示在检测扩增子及第1～4轮差异产物中均可见阳性杂交信号,而驱赶扩增子中无杂交信号;快速Northern杂交证实干预组细胞总RNA的两处杂交信号均较对照组强;阵列膜同一克隆两个点对应的杂交信号呈高度相关一致性,共得到120个差异表达克隆(56个表达上调,64个表达下调).结论cDNA代表性差异分析法联合cDNA阵列点杂交方法能有效快速高通量筛查E2诱导MG-63差异表达基因.
关键词： cDNA代表性差异分析法 cDNA阵列 -
雌二醇诱导人成骨样MG-63细胞表达下调基因的筛查
目的 筛查17 β雌二醇(E2)诱导MG-63细胞下调表达cDNA片段,寻找MG-63细胞中E2相关基因,探讨雌激素的骨保护作用机制.方法 用改良cDNA代表性差异分析法筛查E2干预MG-63细胞表达下调的cDNA片段,Southern杂交和快速Northern杂交分析cDNA片段来源后,克隆到pGEM-T easy载体,蓝白筛选挑取阳性克隆进行测序和同源性比较分析.后选取部分阳性差异表达克隆行Northern杂交分析.结果 得到2个表达下调的cDNA条带,证实差异表达cDNA片段经E2干预后表达下调.随机挑取20个克隆测序得到19个序列,分别代表14个不同基因,均与已知基因高度同源,这些基因与骨基质形成、转录信号转导及细胞分化发育调节等相关,其中1个克隆经Northern杂交证实其受E2干预表达下调.结论 cDNA代表性差异分析法可快速筛查差异表达基因.MG-63细胞受E2诱导下调表达的部分基因可能参与了雌激素介导的骨重建过程从而起到骨保护作用.
关键词： cDNA代表性差异分析法 雌激素 MG-63细胞 基因 -
人成骨肉瘤MG-63细胞雌激素相关基因的分离
目的:筛查17β雌二醇(17β-estradiol, E2) 诱导人成骨肉瘤MG-63细胞株差异表达cDNA片段,寻找雌激素相关基因.方法: 改良的cDNA代表性差异分析法(cDNA representational difference analysis,cDNA RDA)分离E2干预MG-63细胞株表达上调cDNA片段,经Southern和快速Northern 杂交证实表达上调的cDNA片段来源后,将其克隆到pGEM-T easy 载体,蓝白筛选后挑取阳性克隆进行测序和同源比较分析,后选取其中部分克隆行Northern印迹杂交. 结果: 第4轮消减杂交得到5个E2诱导人成骨肉瘤MG-63细胞表达上调的差异cDNA条带,Southern和快速Northern 杂交证明表达上调的cDNA片段来自E2干预的MG-63细胞;随机选25个克隆测序得到13个序列,7个与已知基因高度同源;其中2个克隆经Northern杂交证实E2干预后表达上调. 结论:cDNA RDA能有效筛查差异表达基因,人成骨肉瘤MG-63细胞中某些基因受雌激素诱导表达上调,可能与绝经后骨质疏松的发病相关.
关键词： cDNA代表性差异分析法 雌激素 MG-63细胞 差异表达基因
