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应用荧光探针H2DCF-DA检测光照致细胞内活性氧产生的初步研究
目的应用荧光显微镜及新型荧光探针 H2DCF-DA检测在光源照射过程中人脐静脉血管内皮细胞(ECV 304)内活性氧的产生情况.方法将 ECV 304细胞接种于 35 mm培养皿中,24 h后加入 H2DCF-DA,使其终浓度为 10μmol/L,孵育 30 min.利用荧光显微镜的激发光源作为照射光源,在采集荧光图像的同时完成光源照射,光源输出波长范围为 460～490 nm,功率密度约为 100 mW/cm2.连续采集 DCF的荧光图,观察细胞内 DCF荧光的变化情况,采用计算机图像处理和分析技术,求得细胞内不同照射时间点 DCF平均荧光强度,进而得到平均荧光强度-时间曲线.另外,使用线粒体特异标记探针 MitoFluor Red 589与 H2DCF-DA共同孵育细胞,分别采集同一细胞的 DCF的荧光图和 MitoFluor Red 589的荧光图,并利用像素-荧光强度分析方法来确定 DCF荧光在细胞内的分布位置.结果在光源照射的开始阶段,ECV 304细胞内的 DCF荧光强度迅速增加,在第 10s时便上升至第 2s时的 2.2倍,但是随着照射时间逐渐延长,荧光强度增幅逐渐变小,到第 60s时上升至第 2s时的4.7倍.观察时间进一步延长,DCF的荧光强度的变化似乎进入平台期,继而开始出现下降.考察 DCF荧光在 ECV 304细胞内的分布位置主要通过比较细胞内不同区域的 I1/I2值,通过图像分析与计算得到线粒体区、细胞核区以及细胞质非线粒体区内 I1/I2值分别为 1.9490±0.2209、1.1128±0.2256、0.9413±0.0853.结论荧光探针技术和图像分析技术应用于细胞内活性氧的检测,方法简便、结果可靠.光照可致 ECV 304细胞内活性氧产生,且主要位于线粒体内,这可能与线粒体内内源性光敏物质丰富有关,但尚不能完全排除该荧光探针自身性质致使上述现象出现的可能.
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两种荧光图像采集设备在采集快速变化荧光图像方面的初步比较
目的通过对激光扫描共聚焦显微镜和CCD荧光显微镜采集的DCF探针荧光图像质量的比较,选择适合于快速变化荧光的图像采集设备.方法应用荧光探针H2DCF-DA孵育ECV 304细胞后(孵育浓度为10μmol/L,孵育时间30 min),分别利用激光扫描共聚焦显微镜和CCD荧光显微镜采集DCF荧光图像,并比较两者的成像质量.结果随着光照致活性氧的产生,DCF荧光的变化速度较快.激光扫描共聚焦显微镜采集的荧光图像表现为细胞内整体的DCF荧光强度增高,图像对比度稍差;而CCD荧光显微镜清晰地呈现细胞内的细节信息,准确地反映了细胞内DCF早期的分布位置.结论在采集快速变化的荧光图像时,CCD荧光显微镜系统优于激光扫描共聚焦显微镜系统.
关键词： 激光扫描共聚焦显微镜 CCD荧光显微镜 H2DCF-DA
