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HLA-A*0201-BSP融合基因的构建与原核表达
克隆表达可生物素化的HLA-A*0201的重链胞外区是制备HLA-A*0201-肽四聚体的先决条件.本研究构建重组HLA-A*0201-BSP融合基因的表达载体,以制备HLA-A2四聚体.根据已报道的序列设计特异引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从已鉴定为HLA-A*0201基因型的健康人白细胞中克隆HLA-A*0201重链胞外区的基因,拼接上依赖生物素-蛋白连接酶(biotin-protein ligase,BirA)的可生物素化序列(BirA substrate peptide,BSP),构建HLA-A *0201-BSP的原核表达载体,在大肠杆菌DH5α中进行表达.结果表明:成功扩增出HLA-A*0201-BSP融合基因并测序证实,构建的pBV220-HLA-A*0201-BSP可在大肠杆菌DH5α中高效表达HLA-A*0201-BSP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的28%,以包涵体的形式表达,经洗涤、变性后,以Sepharcyyl S-300 HR(S-300)柱层析纯化,纯度可达90%以上.结论:获得了高效表达HLA-A*0201-BSP的大肠杆菌工程菌株,建立了简便有效的包涵体纯化方法,为制备HLA-A*0201-肽四聚体奠定了基础.
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HLA-A2+供者外周血hCMV特异性CTL的定量及其表型分析
目的: 利用加载人巨细胞病毒(hCMV)结构蛋白pp65衍生抗原肽NLV(pp65495-503)的HLA-A*0201(A2-NLV)四聚体, 探讨四聚体染色条件的优化及其在特异性CTL表型分析中的应用.方法: 取HLA-A2+供者外周血, 以A2-NLV四聚体/PE在不同条件下染色, 然后以anti-CD3-FITC和anti-CD8-APC标记, 流式细胞术分析染色结果, 寻找四聚体佳染色条件, 并分析特异性CTL的表型和活化抗原表达.结果: 以全血样进行四聚体染色结果优于分离的PBMC.A2-NLV四聚体用量为0.3 μg时, 与100 μL全血于4℃温育1 h, 特异性染色效果佳, 而与CD8- T细胞非特异性结合很低.以此优化条件进行特异性CTL表型分析, 结果显示CD28阳性的A2-NLV四聚体特异性CTL的百分率较非特异性CTL低, 表达CD57的百分率较非特异性CTL高, CD25分子只表达于活化的特异性CTL上.结论: 通过对染色条件进行优化可明显提高四聚体染色的特异性, 降低非特异性结合, 优化的四聚体染色法能用于抗原特异性CTL的表型和功能分析.
