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剪切力对脑微血管内皮细胞形态学的影响
我们利用自行研制的细胞流动小室对大鼠脑微血管内皮细胞在剪切力作用下的形态学改变进行了初步研究.结果提示脑微血管内皮细胞对剪切力的耐受性要低于大血管内皮细胞,在同样的剪切力和作用时间下,大血管内皮细胞没有明显变化.微血管内皮细胞已有明显的形态学变化,细胞间隙明显增大、细胞皱缩、脱落,这些改变的直接后果是通透性的增加.我们的工作为进一步开展剪切力对微血管内皮细胞功能、代谢等方面的影响提供了实验数据.
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流动状态下ADAMTS13羧基端的功能研究
目的 研究ADAMTS13及其突变体于体外流动状态下裂解血管性血友病因子(VWF),降低血小板粘附形成血栓能力的差异.方法 将全长ADAMTS13(FL)及缺失TSP2-8CUB1+2(MDTCS)和缺失CUB1+2(delCUB)cDNA质粒瞬时转染COS7细胞,Western blot检测各瞬时表达细胞分泌的蛋白.利用流体力学装置平板流动小室(Flow Chamber)培养人脐静脉内皮细胞,并通过蠕动泵加压流动培养液模拟人体血管内流动状态,荧光显微镜观测加入ADAMTS13或其突变体蛋白后荧光标记的血小板聚集状态的差异.结果 成功在真核表达细胞内瞬时表达ADAMTS13及其突变体蛋白,简单纯化并经Western blot检测各表达蛋白相对分子量与预期一致.Flow Chamber模拟人体血管内剪切力作用下,FL蛋白和MDTCS蛋白可以不同程度地抑制血小板凝集,delCUB蛋白抑制血小板凝集的能力显著下降.结论 成功瞬时表达全长ADAMTS13及其突变体蛋白.初步证实流动状态下ADAMTS13羧基端是参与裂解VWF以抑制血小板凝集的主要区域.
关键词： 血管性血友病因子裂解酶 突变体 剪切力 流动小室 -
体外呼吸道上皮细胞细菌黏附模型的建立
目的 基于流动小室的构架,建立一种用以研究细菌在呼吸道上皮细胞黏附的体外模型.方法 以2 mg/mL牛胶原蛋白预包被流动小室后,接种1 × 105个HBE细胞,含20％ 血清的RPMI1640培养基,37 ℃,5 ％CO2孵箱培养24 h铺满底部后用于实验;以流动小室中细胞数量为评价指标,正交设计考察流速、流动时长和流动相成分对细胞模型的影响,筛选优实验条件;以正交实验结果 为条件,细菌黏附量为指标,与常规用于细菌细胞黏附的培养板方法 相比较,分别于2 × 108、108、5 ×107、2.5 × 107CFU/mL接种浓度下与细胞进行黏附实验,判定流动小室是否为细菌细胞黏附研究的可靠模型;以SYTO9荧光标记细菌的方法 表征黏附于细胞的细菌量.结果 优化得到佳实验条件,影响因素主次为流速＞ 流动时长＞ 流动相组成,方差分析结果 显示,流速和流动时长影响因素有显著差异(P＜ 0.05) ,流动相组成无显著差异(P＞ 0.05) .荧光染色后,该模型可实现细菌在呼吸道上皮细胞上黏附的荧光实时观察;细菌黏附的定量结果 显示,随着感染复数增大,流动小室模型与常规培养板方法均检测出黏附细菌的增多,且呈线性关系;但同一感染复数下常规培养板方法 所检测出的黏附菌量与流动小室模型相比显著增多(P＜ 0.05) .结论 在适宜的流速、流动时长下,该模型可用于研究细菌在呼吸道上皮细胞上黏附,并且较常规培养板方法 具有更贴近体内环境、准确度高、可实时观察等优点.
