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结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药相关蛋白的原核表达及纯化
目的 构建结核分枝杆菌pncA基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶的表达蛋白. 方法 制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段；通过pET28a构建表达载体pET28a-pncA,序列测定证实正确后转化大肠埃希菌DH10b,经IPTG诱导表达His-吡嗪酰胺酶融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot 分析重组蛋白. 结果 扩增出结核分枝杆菌pncA基因并构建了具有正确基因序列的质粒载体pET28a-pncA,转化大肠埃希菌BL21后经诱导产生了分子质量单位约20 ku的表达产物,并得到纯化的带His标签的目的蛋白. 结论 构建了结核分枝杆菌pncA基因原核表达质粒,并诱导表达了His-吡嗪酰胺酶融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺耐药性奠定了基础.
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河南省结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药基因pncA分析
目的 了解河南地区结核分枝杆菌耐吡嗪酰胺(PZA)分离株pncA基因突变情况,探讨与耐PZA之间的关系. 方法 对41例结核分枝杆菌临床分离株进行常规培养和药敏检测,采用聚合酶链反应-测序技术检测pncA基因的突变. 结果 有68.29％ (28/41)的耐药菌株pncA发生突变从而改变了吡嗪酰胺酶氨基酸序列的一级结构.28株临床分离突变株涵盖碱基替代、插入突变和缺失突变等类型.突变分布在pncA基因整个序列,位于开读框架的3～535位的核苷酸. 结论 河南地区结核分枝杆菌耐PZA主要机制之一为pncA基因突变.
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结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶-GST融合蛋白表达载体构建及在大肠杆菌中的表达
目的 构建结核分枝杆菌pncA基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶的表达蛋白.方法 制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应技术扩增目的基因片段;通过pGEX4T-1构建表达载体pGEX4T-pncA,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌DH10b,再经IPTG诱导表达谷胱甘肽S转移酶(GST)-吡嗪酰胺酶融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白.结果 扩增出了结核分枝杆菌pncA基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX4T-pncA,转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物.结论 构建了质粒载体,并诱导表达了GST-吡嗪酰胺酶融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺耐药性奠定了基础.
