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La核糖核蛋白6对人血管内皮细胞增殖与凋亡的作用
目的 研究La核糖核蛋白6(Achn)在人血管内皮细胞增殖和凋亡中的调节作用.方法 (1)DMEM无血清培养基培养人血管内皮细胞株Eahy926细胞,按随机数字表法(下同)分为Achn抑制组(转染Achn抑制表达载体psi-Achn)、psi4.1空载体组(转染psi4.1)、Achn诱导组(转染Achn诱导表达载体pcDNA-Achn)、pcDNA3.1空载体组(转染pcDNA3.1)、Achn与钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)共转染组(转染pcDNA-Achn与CASK抑制表达载体psi-CASK)、空白对照组(PBS处理),分别于转染后1、24、48、72 h用噻唑蓝法测定各组细胞570 nm波长下的吸光度值.(2)取Eahy926细胞,裂解细胞总蛋白,二辛丁酸法定量后分为蛋白质印迹组(总蛋白量为20μg)、Achn蛋白沉淀组、CASK蛋白沉淀组、IgG对照组,后3组细胞蛋白总量各为100μg,免疫共沉淀法检测各组Achn、CASK蛋白水平.(3)取Eahy926细胞分为LPS组(5 mol/L LPS处理)、氯化钾组(5 mol/L氯化钾处理)、空白对照组(5 mol/L PBS处理)、Achn诱导转染组(转染pcDNA-Achn)、Achn与CASK共转染组(转染pcDNA-Achn与psi-CASK),转染组转染24 h后加入LPS刺激12 h,免疫组织化学法检测各组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白表达.(4)取Eahy926细胞分为Achn诱导组(转染pcDNA-Achn)、Achn抑制组(转染psi-Achn)、对照组(PBS处理),24 h后加入烧伤患者血清处理12 h,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率.对实验数据行t检验和单因素方差分析.结果 (1)Achn抑制组细胞增殖水平从24 h开始低于psi4.1空载体组,48、72 h时差异均有统计学意义(t值分别为10.777、6.112,P值均小于0.05);转染后24、48、72 h Achn诱导组细胞增殖水平均显著高于pcDNA3.1空载体组(t值分别为5.367、6.053、9.831,P值均小于0.05);Achn与CASK共转染组细胞增殖水平48、72 h均显著低于Achn诱导组(t值分别为5.481、9.517,P值均小于0.05).(2)CASK蛋白沉淀组CASK抗体沉淀物中可同时检测到CASK蛋白和Achn蛋白,而Achn蛋白沉淀组Achn抗体沉淀物中可同时检测到Achn蛋白和CASK蛋白.(3)Achn诱导转染组血管内皮细胞caspase-3阳性表达率为(15.6±0.5)%,低于LPS组[(32.8±2.6)%,t=10.083,P＜0.05];Achn与CASK共转染组caspase-3阳性细胞表达率[(7.0±2.0)%]进一步降低,显著低于LPS组(t=9.827,P＜0.01).(4)Achn抑制组细胞凋亡率为(45.6±10.9)%,显著高于对照组的(13.2±4.3)%,t=7.043,P＜0.05;Achn诱导组的细胞凋亡率为(5.3±2.9)%,显著低于对照组(t=6.499,P＜0.05).结论Achn能促进入血管内皮细胞增殖,抑制LPS或烧伤血清诱导细胞凋亡并与CASK的作用相关联.
