受体相互作用丝氨酸-苏氨酸激酶3在胆汁淤积性肝损伤中的作用及机制

目的 探讨受体相互作用丝氨酸-苏氨酸激酶3(RIP3)在胆汁淤积性肝损伤中的作用及机制.方法 采用实验研究方法.(1)肝星状细胞株HSC-T6细胞处理和活性检测:采用RIP3-siRNA和NC-siRNA转染HSC-T6细胞.采用CCK8法检测未转染、转染RIP3-siRNA、转染NC-siRNA的HSC-T6细胞存活率.采用100 μmol/L甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)试剂处理HSC-T6细胞后0、2、4、8、12 h取材细胞并保存,检测12 h细胞存活率.采用100 μmol/L GCDCA试剂处理RIP3敲低HSC-T6细胞后培养12h,检测细胞存活率.(2)胆管结扎小鼠模型建立:采用随机数字表法将40只小鼠分为8组,每组5只.Sham组:仅游离胆总管,不结扎,于术后第7天取下腔静脉血和肝组织;BDL-1 d组、BDL-3 d组、BDL-5 d组、BDL-7 d组、BDL-14 d组、BDL-21 d组、BDL-28 d组:分别于行胆总管结扎术后第1、3、5、7、14、21、28天取材.(3)RT-PCR检测细胞和肝组织RIP3、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TNF-α mRNA相对表达量.(4) Westernblot检测细胞和肝组织RIP3、α-SMA、TNF-α蛋白相对表达量.正态分布的计量资料以-x±s表示,不同时间点数据检验采用方差分析,多组间比较采用方差分析,两组间比较采用t检验.结果 (1)不同HSC-T6细胞活性和RIP3、α-SMA、TNF-α mRNA及蛋白表达情况:CCK8检测结果显示:采用100μmol/L GCDCA试剂处理HSC-T6细胞和RIP3敲低HSC-T6细胞后12 h细胞存活率分别为61.3％±0.3％和83.2％±0.4％,与未采用100 μmol/L GCDCA试剂处理HSC-T6细胞和RIP3敲低HSC-T6细胞培养12h存活率(98.4％±0.7％和97.4％±0.7％)4者比较,差异有统计学意义(F=115.200,P＜0.05).其中后两者比较,差异无统计学意义(t=1.283,P＞0.05);未采用100 μmol/L GCDCA试剂处理HSC-T6细胞存活率分别与采用100 μmol/L GCDCA试剂处理HSC-T6细胞和RIP3敲低HSC-T6细胞存活率比较,差异均有统计学意义(t=17.910,6.604,P＜0.05);采用100 μmol/L GCDCA试剂处理HSC-T6细胞和RIP3敲低HSC-T6细胞存活率比较,差异有统计学意义(t=7.186,P＜0.05).RT-PCR检测结果显示:未转染、转染RIP3-siRNA、转染NC-siRNA的HSC-T6细胞RIP3 mRNA相对表达量分别为0.012 1±0.001 3、0.011 2±0.003 1、0.0028±0.0005,3者比较,差异有统计学意义(F=20.410,P＜0.05).其中未转染的HSC-T6细胞RIP3 mRNA相对表达量与转染NC-siRNA的HSC-T6细胞比较,差异无统计学意义(t=0.483,P＞0.05);转染RIP3-siRNA的HSC-T6细胞RIP3 mRNA相对表达量分别与未转染、转染NC-siRNA的HSC-T6细胞比较,差异均有统计学意义(t=11.760,4.586,P＜0.05).采用GCDCA试剂处理HSC-T6细胞后0、2、4、8、12 h RIP3 mRNA相对表达量分别为0.012 1±0.001 3、0.011 2±0.003 1、0.021 2±0.002 2、0.027 8±0.002 1、0.029 8±0.002 3,α-SMAmRNA相对表达量分别为0.571 ±0.012、0.611 ±0.024、0.691 ±0.021、0.711 ±0.021、0.752±0.031,TNF-αmRNA相对表达量分别为0.873±0.022、0.912±0.024、1.015±0.031、1.210±0.042、1.471±0.041,3者相对表达量均随时间延长升高,差异均有统计学意义(F=70.720,30.050,166.700,P＜0.05).未采用GCDCA试剂处理HSC-T6细胞RIP3 mRNA相对表达量为0.012 1±0.001 3,采用GCDCA试剂处理HSC-T6细胞12h后RIP3 mRNA相对表达量为0.029 8±0.002 3,两者比较,差异有统计学意义(t=13.970,P＜0.05).Westem blot检测结果显示:未转染、转染RIP3-siRNA、转染NC-siRNA的HSC-T6细胞RIP3蛋白相对表达量分别为0.054±0.012、0.013±0.008、0.052±0.021,3者比较,差异有统计学意义(F=7.410,P＜0.05).其中未转染的HSC-T6细胞RIP3蛋白相对表达量与转染NC-siRNA的HSC-T6细胞比较,差异无统计学意义(t=0.143,P＞0.05);转染RIP3-siRNA的HSC-T6细胞RIP3蛋白相对表达量分别与未转染、转染NC-siRNA的HSC-T6细胞比较,差异均有统计学意义(t=4.924,3.006,P＜0.05).采用GCDCA试剂处理HSC-T6细胞后0、2、4、8、12 h RIP3蛋白相对表达量分别为0.045±0.024、0.047±0.034、0.062±0.025、0.121±0.015、0.154±0.034,α-SMA蛋白相对表达量分别为0.064±0.031、0.072±0.017、0.097±0.035、0.078±0.031、0.254±0.051,TNF-α蛋白相对表达量分别为0.078±0.025、0.094±0.037、0.129±0.041、0.198±0.011、0.324±0.061,3者相对表达量均随时间延长升高,差异均有统计学意义(F=9.658,15.810,20.090,P＜0.05).未采用GCDCA试剂处理HSC-T6细胞RIP3蛋白相对表达量为0.045±0.024,采用GCDCA试剂处理HSC-T6细胞12h后RIP3蛋白相对表达量为0.154±0.034,两者比较,差异有统计学意义(t=4.536,P＜0.05).(2)各组小鼠肝组织中RIP3、α-SMA、TNF-α mRNA及蛋白表达情况:RT-PCR检测结果显示:Sham组、BDL-1 d组、BDL-3 d组、BDL-5 d组、BDL-7 d组、BDL-14 d组、BDL-21 d组、BDL-28 d组小鼠肝组织中RIP3 mRNA相对表达量为0.047 3±0.003 1、0.041 2±0.007 8～0.339 7±0.017 1,α-SMA mRNA相对表达量为2.948±0.612、2.654±1.032～ 8.387±0.910,TNF-α mRNA相对表达量为0.563±0.078、0.610±0.113～1.078±0.289,各组小鼠上述指标比较,差异均有统计学意义(F=25.180,27.820,7.425,P＜0.05).Westernblot检测结果显示:Sham组、BDL-1 d组、BDL-3 d组、BDL-5 d组、BDL-7 d组、BDL-14 d组、BDL-21 d组、BDL-28 d组小鼠肝组织中RIP3蛋白相对表达量为0.245±0.011、0.228±0.023～1.018±0.052,α-SMA蛋白相对表达量为0.424±0.057、0.392±0.041～0.985±0.081,TNF-α蛋白相对表达量为0.551±0.052、0.588±0.087～0.962±0.074,各组小鼠上述指标比较,差异均有统计学意义(F=19.160,94.410,22.750,P＜0.05).结论 胆汁淤积通过诱导TNF-α通路活化,并上调RIP3,促进肝损伤和纤维化.