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β-榄香烯对肺癌A549细胞的差异基因筛选及鉴定
目的:筛选β-榄香烯处理前后肺癌A549细胞的差异基因并对其进行鉴定,为进一步研究靶基因的功能奠定基础.方法:CCK-8法检测β-榄香烯对肺癌A549及H1299细胞的增殖抑制作用及其对肺癌A549细胞的药物敏感性;运用基因芯片技术检测β-榄香烯处理前后A549细胞的基因表达谱变化并筛选出差异基因进行数据分析;使用实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time Quantitative PCR Detecting System, qPCR)筛选出与基因芯片实验结果一致且表达丰度较高的基因,构建慢病毒干扰载体,高内涵细胞功能学筛选(HCS)实验选择增殖抑制明显的基因,进而进行阳性基因单靶点筛选,并用qPCR和Western-Blot分别对阳性靶点进行鉴定.结果:CCK-8法两轮增殖检测结果:β-榄香烯对人肺癌A549细胞的半数抑制浓度(IC50)值较H1299细胞稳定,选用A549细胞进行后续实验细胞;A549细胞药敏试验结果:随着时间和浓度的升高,A549细胞对β-榄香烯的药物敏感性增加,呈一定的时间和浓度依赖性;基因芯片技术筛选出β-榄香烯处理前后A549细胞有差异表达的基因721个,其中上调基因273个,下调基因448个,从下调基因筛选出30个在肺癌中尚未报道但可能具有潜在功能的基因;运用qPCR筛选出20个基因进行HCS筛选,结果显示慢病毒转染后细胞增殖抑制表型明显的基因为POLE2;qPCR检测单靶点RNAi效率,结果显示shPOLE2-PSC34533基因敲减效率达75.6%(P<0.05).Western-Blot鉴定结果显示靶点对POLE2基因的外源表达在蛋白质水平有显著的敲减作用,进一步证实POLE2是有效靶点.结论:β-榄香烯可下调肺癌A549细胞POLE2基因的表达,其可能为肺癌临床治疗的一个潜在靶点.
