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酵母菌胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因系统对人原代T细胞的作用
目的:酵母菌胞嘧啶脱氨酶基因(YCD) 是新型自杀基因, 利用重组逆转录病毒载体(RV), 将YCD高效导入人原代T细胞, 并在体内外探讨转基因T细胞的功能及"自杀"效应.方法:构建RV载体MSCV-YCD-puroR, 瞬时质粒共转染法制备RV, 流动感染法或Retronectin+离心法感染人原代T细胞, 嘌呤霉素筛选获得T-YCD-puroR, 检测转基因T细胞对肿瘤细胞的杀伤及细胞因子分泌功能, 在体外和SCID小鼠体内, 探讨前体药物5氟胞嘧啶(5-FC)对T-YCD-puroR细胞的杀伤效应等.结果:病毒滴度为(5.0±3.7)×106 TU/mL.流动转染法对人原代T细胞的基因导入率46.0%±9.6%, 2轮离心+Retronectin法的基因导入率为60.3%±7.6%(n＝3).经嘌呤霉素筛选48 h获得T-YCD-puroR细胞, 其基因阳性率96.7%±1.5%, 并可大量扩增.与野生T细胞比较, T-YCD-puroR细胞杀伤K562肿瘤细胞的能力及细胞因子分泌功能无统计学意义.体外实验显示, 与野生T细胞比较, T-YCD-puroR细胞对puromycin的IC50上升了304.9倍(0.071 mg/L vs 22.3 mg/L), 对5-FC的IC50下降了133.3倍(656.0 μmoL/L vs 4.9 μmoL/L).T-YCD-puroR细胞静脉接种于SCID小鼠, 7d后每只小鼠腹腔注射5 μmoL的5-FC, 连续7 d, 首次给药24 h后即可观察到SCID小鼠外周血中CD45+细胞显著下降(P＜0.01).结论:YCD自杀基因导入对人原代T细胞功能无显著影响, T-YCD-puroR细胞可以在体内外被5-FC有效杀伤.本研究为进一步研究打下了良好的基础.
