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bcl-2基因对血管内皮细胞保护作用的研究
目的探讨转染bcl-2基因对血管内皮细胞的保护作用.方法1.重组真核细胞表达载体:将含编码人bcl-2 cDNA完整开放阅读框的bcl-2 cDNA重组至逆转录病毒载体pLXSN的EcoR Ⅰ位点上,用脂质体包裹重组质粒导入PA317细胞株,并经G418筛选阳性克隆;收集含重组病毒的上清液.2.用含高滴度重组病毒的上清液感染内皮细胞;用PCR法检测转染细胞bcl-2基因和Neo基因,用免疫组织化学方法检测转染细胞bcl-2蛋白表达以证实转染成功.设pLXSN/s-bcl-2、pLXSN、未转染三组.3.观察各组血管内皮细胞在正常培养条件下的生长特征情况,以及在无血清、10%CO2以及10-7M的AngⅡ等不同刺激因素下各组培养血管内皮细胞的生存能力的变化.结果1.成功的重组含bcl-2的真核细胞表达质粒,并经碱基自动测序检测未发现重组的bcl-2基因有碱基丢失或错义配对;2.经PCR检测bcl-2片段和Neo基因片段以及免疫组织化学方法检测转染细胞的bcl-2蛋白表达证实转染成功并获得表达.3.在正常培养条件下各组血管内皮细胞间的形态和生存率无显著差异(p＞0.05);4.转染bcl-2基因组血管内皮细胞在无血清、10%CO2以及10.MAngⅡ等刺激因素下的存活率明显高于转染pLXSN组和未转染组(P＜0.05).结论转染bcl-2基因能显著提高血管内皮细胞的抗损伤能力.
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GDNF基因逆转录病毒表达载体的构建与鉴定
应用基因重组技术将大鼠GDNF cDNA克隆到逆转录病毒载体pLXSN中，用限制性内切酶酶切分析重组质粒pLXSN-GDNF中GDNF基因的插入方向，用PCR、斑点杂交和Southern杂交对重组质粒作进一步鉴定。结果表明：GDNF cD-NA已正确地克隆到逆转录病毒载体pLXSN中而构建成重组逆转录病毒载体，成功构建的真核细胞表达载体可作为基因治疗的高效基因转移载体。本研究为进一步开展GDNF基因治疗Parkinson’s disease和Alzheimer's disease等中枢神经系统疾病提供了资料。
