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异亮氨酸拉链修饰的可溶性CD40L在巴斯德毕赤酵母中的表达
为了获得异亮氨酸拉链修饰的可溶性CD40L(IZ-sCD40L)在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达,首先用PCR和重叠PCR的方法得到了IZ-sCD40L基因片段,然后构建了巴斯德毕赤酵母表达质粒pPICZαA-IZ-sCD40L,核酸测序分析表明IZ-sCD40L的基因片段正确克隆到pPICZαA质粒中,将其线性化后,电转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,PCR筛选阳性重组菌株,经表型鉴定后,用甲醇进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot印迹杂交结果证实了表达产物为重组IZ-sCD40L的融合蛋白.
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重组人sCD40L-IZ基因的克隆、原核表达及重组三聚体蛋白的鉴定
目的: 克隆并表达有生物学活性的CD40配体(CD40 ligand, CD40L)重组蛋白.方法: 应用PCR技术克隆CD40L胞外功能区(E107-L261)基因, 并在其N端融合异亮氨酸拉链(isoleucine zipper, IZ)促使其形成三聚体活性形式, 同时为了后期纯化的需要, 在IZ的N端融合6个His, 将所融合得到的sCD40L-IZ克隆进入pET30a表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3)表达体系进行诱导表达.结果: 重组蛋白sCD40L-IZ以包涵体形式在大肠杆菌(BL21)中得到较高水平的表达.通过蛋白的变性、复性和HiTrapTM亲和层析获得了纯度达95%以上的sCD40L-IZ重组蛋白.经凝胶过滤层析和非还原SDS-PAGE分析验证了其确有三聚体形式.激光共聚焦实验结果表明, 重组蛋白sCD40L-IZ可与骨髓瘤细胞株XG2表面CD40分子结合, 并促使其在膜表面发生聚集.结论: 人sCD40L-IZ重组蛋白在大肠杆菌体系得以成功表达, 并以三聚体活性形式发挥功能, 为今后进一步研究其与凋亡、疾病发病机制的关系及其在临床治疗中的应用奠定了基础.
