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内质网钙稳态蛋白文献资料
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硒蛋白K基因干扰对T淋巴细胞内质网钙稳定蛋白的影响
目的 探讨SelK mRNA干扰效果及其硒蛋白K(SelK)基因干扰后对细胞内质网钙稳态蛋白(endoplasmic reticulum calcium homeostasis protein,CHERP)的表达,观察T淋巴细胞内Ca2+浓度的变化.方法 从SelK mRNA(NM_019979.2)的编码序列中符合设计要求的靶位点设计特异性干扰SelK mRNA的RNAi片段,构建shRNA干扰载体靶向干扰SelK RNA,用核酸序列分析方法分析重组片段的正确性,利用荧光定量PCR和Westeron blot鉴定SelK mRNA的干扰效果,采用Real time-PCR的方法检测SelK干扰后细胞内的CHERP的变化.结果 阳性重组载体可以被BamHI酶切.酶切片段序列分析重组子质粒结果与所设计片段完全一致,正确率为100.0％.三个ShRNA表现了不同的干扰效果,sh222、sh102和sh101的干扰效率分别为12.13％、16.46％和42.37％,在核酸水平上重组质粒sh101对SelK的干扰效果佳,与sh222和sh102相比,差异有统计学意义(P＜0.01).Western blot检测重组质粒sh101在蛋白水平上的干扰效率为45.4％,干扰组细胞中CHERP的表达与对照组相比抑制率达到40.0％.结论 重组质粒sh101对SelK在核酸和蛋白质水平上都有较好的干扰效率,SelK干扰对细胞中CHERP的表达有抑制的作用,或因此打乱了内质网与胞质中的钙离子平衡,从而影响到了细胞内游离的钙离子浓度,是导致T淋巴细胞激活的因素之一.
