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胰岛素抵抗受体底物-4文献资料
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GST-IRS-4原核表达载体的构建、表达及抗 GST-IRS4多克隆抗体的制备
目的:在大肠杆菌中表达胰岛素抵抗受体底物-4( insulin receptor substrate 4, IRS4)与谷胱甘肽-S转移酶的融合蛋白,并制备抗 IRS4的多克隆抗体( pAb).方法:从肝癌细胞系 Hep G2提取总 RNA,用 RT-PCR扩增出 IRS4 PTB结构域的cDNA,克隆入表达载体pGEX-Teasy中,重组载体酶切鉴定后,在大肠杆菌中经 IPTG诱导表达获得GST-IRS4蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,包涵体经变性复性后,通过亲和层吸法纯化表达的 GST-IRS4融合蛋白,并以此为抗原制备 pAb. Western blot 检测重组抗原的免疫活性.结果:酶切及测序鉴定证明, IRS4基因已正确插入到 pGEX-Teasy中,经 IPTG诱导后,表达出相对分子量为 44ku的融合蛋白.用 Western blot 鉴定所制备的多克隆抗体可以与 IRS4特异性结合.结论: IRS4片段在大肠杆菌中的成功表达及制备得到多克隆抗体,为检测 IRS4及其在其他组织中的表达,进一步研究磷酸化酪氨酸结合结构域( PTB)的结构和生物学功能奠定基础.
关键词： 大肠杆菌 多克隆抗体 胰岛素抵抗受体底物-4
